1. R-3.0.1-win.exe（32/64 bitともにこれ）をクリックして「実行する」を選択
2. 聞かれるがままに「次へ」などを押してとにかくインストールを完了させる
3. Windows Vistaの人は（パッケージのインストール中に書き込み権限に関するエラーが出るのを避けるために）「コントロールパネル」−「ユーザーアカウント」−「ユーザーアカウント制御の有効化または無効化」で、 「ユーザーアカウント制御（UAC）を使ってコンピュータの保護に役立たせる」のチェックをあらかじめ外しておくことを強くお勧めします。
4. インストールが無事完了したら、デスクトップに出現する「R3.0.1 (32 bitの場合)」または「R x64 3.0.1 (64 bitの場合)」アイコンをダブルクリックして起動
5. 以下を、「R コンソール画面上」でコピー&ペーストする。10GB程度のディスク容量を要しますが一番お手軽です。（どこからダウンロードするか？と聞かれるので、その場合は自分のいる場所から近いサイトを指定）

   ------    ここから    ------
   install.packages(available.packages()[,1])                     #CRAN中にある全てのパッケージをインストール
   
   source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R")               #おまじない
   biocLite(all_group())                                          #Bioconductor中にある全てのパッケージをインストール
   
   ------    ここまで    ------
   

6. 「コントロールパネル」−「フォルダオプション」−「表示（タブ）」−「詳細設定」のところで、「登録されている拡張子は表示しない」のチェックを外してください。

以下は（2011/12/26まで掲載していた）昔の5.のところの記述（基本的にやらなくてよい）
------    ここから    ------
source("http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/R/R_functions.R")#門田が作成した関数群をロード

source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R")               #おまじない
install.packages("ascii",dep=T)                                #asciiパッケージのインストール
install.packages("Epi",dep=T)                                  #Epiパッケージのインストール
install.packages("NBPSeq",dep=T)                               #NBPSeqパッケージのインストール
biocLite("ArrayExpressHTS", dependencies=TRUE)                 #ArrayExpressHTSパッケージのインストール
biocLite("baySeq", dependencies=TRUE)                          #baySeqパッケージのインストール
biocLite("biomaRt", dependencies=TRUE)                         #biomaRtパッケージのインストール
biocLite("Biostrings", dependencies=TRUE)                      #Biostringsパッケージのインストール
biocLite("ChIPpeakAnno", dependencies=TRUE)                    #ChIPpeakAnnoパッケージのインストール
biocLite("chipseq", dependencies=TRUE)                         #chipseqパッケージのインストール
biocLite("ChIPseqR", dependencies=TRUE)                        #ChIPseqRパッケージのインストール
biocLite("ChIPsim", dependencies=TRUE)                         #ChIPsimパッケージのインストール
biocLite("cosmo", dependencies=TRUE)                           #cosmoパッケージのインストール
biocLite("CSAR", dependencies=TRUE)                            #CSARパッケージのインストール
biocLite("DEGseq", dependencies=TRUE)                          #DEGseqパッケージのインストール
biocLite("DESeq", dependencies=TRUE)                           #DESeqパッケージのインストール
biocLite("DEXSeq", dependencies=TRUE)                          #DEXSeqパッケージのインストール
biocLite("DiffBind", dependencies=TRUE)                        #DiffBindパッケージのインストール
biocLite("edgeR", dependencies=TRUE)                           #edgeRパッケージのインストール
biocLite("GeneR", dependencies=TRUE)                           #GeneRパッケージのインストール
biocLite("GenomicRanges", dependencies=TRUE)                   #GenomicRangesパッケージのインストール
biocLite("girafe", dependencies=TRUE)                          #girafeパッケージのインストール
biocLite("goseq", dependencies=TRUE)                           #goseqパッケージのインストール
biocLite("pasilla", dependencies=TRUE)                         #pasillaパッケージのインストール
biocLite("PICS", dependencies=TRUE)                            #PICSパッケージのインストール
biocLite("qrqc", dependencies=TRUE)                            #qrqcパッケージのインストール
biocLite("r3Cseq", dependencies=TRUE)                          #r3Cseqパッケージのインストール
biocLite("RCurl", dependencies=TRUE)                           #RCurlパッケージのインストール
biocLite("REDseq", dependencies=TRUE)                          #REDseqパッケージのインストール
biocLite("rGADEM", dependencies=TRUE)                          #rGADEMパッケージのインストール
biocLite("rMAT", dependencies=TRUE)                            #rMATパッケージのインストール
biocLite("ROC", dependencies=TRUE)                             #ROCパッケージのインストール
biocLite("Rsubread", dependencies=TRUE)                        #Rsubreadパッケージのインストール
biocLite("Rsamtools", dependencies=TRUE)                       #Rsamtoolsパッケージのインストール
biocLite("segmentSeq", dependencies=TRUE)                      #segmentSeqパッケージのインストール
biocLite("seqLogo", dependencies=TRUE)                         #seqLogoパッケージのインストール
biocLite("ShortRead", dependencies=TRUE)                       #ShortReadパッケージのインストール
biocLite("SRAdb", dependencies=TRUE)                           #SRAdbパッケージのインストール

------    ここまで    ------

1. Marioni et al., Genome Res., 2008のSupplementary table 2のデータ。
   「Kidney 7 samples vs Liver 7 samples」のRNA-seqの遺伝子発現行列データです。
   SupplementaryTable2.txtです。
   サンプルは二つの濃度(1.5 pM and 3 pM)でシーケンスされており、「3 pMのものが5 samples vs. 5 samples」、「1.5 pMのものが2 samples vs. 2 samples」という構成です。 SupplementaryTable2.txtをエクセルで開くと、7列目以降に発現データがあることがわかります。詳細な情報は以下の通りです(原著論文中のFigure 1からもわかります)：
   -------------------------
   7列目：R1L1Kidney (3 pM)
   8列目：R1L2Liver (3 pM)
   9列目：R1L3Kidney (3 pM)
   10列目：R1L4Liver (3 pM)
   11列目：R1L6Liver (3 pM)
   12列目：R1L7Kidney (3 pM)
   13列目：R1L8Liver (3 pM)
   14列目：R2L1Liver (1.5 pM)
   15列目：R2L2Kidney (3 pM)
   16列目：R2L3Liver (3 pM)
   17列目：R2L4Kidney (1.5 pM)
   18列目：R2L6Kidney (3 pM)
   19列目：R2L7Liver (1.5 pM)
   20列目：R2L8Kidney (1.5 pM)
   -------------------------
   
2. Marioni et al., Genome Res., 2008のSupplementary table 2のデータを取り扱いやすく加工したデータ。
   オリジナルのものは最初の6列が発現データ以外のものだったり、7列目以降も二種類のサンプルが交互に出てくるなど若干R上で表現しずらかったため、以下のようにわかりやすくしたものです。
   つまり、サンプルを3pMのものだけにして、「1列目:Genename, 2-6列目:Kidney群, 7-11列目:Liver群」と変更したSupplementaryTable2_changed.txtです：
   -------------------------
   2列目：R1L1Kidney (3 pM)
   3列目：R1L3Kidney (3 pM)
   4列目：R1L7Kidney (3 pM)
   5列目：R2L2Kidney (3 pM)
   6列目：R2L6Kidney (3 pM)
   7列目：R1L2Liver (3 pM)
   8列目：R1L4Liver (3 pM)
   9列目：R1L6Liver (3 pM)
   10列目：R1L8Liver (3 pM)
   11列目：R2L3Liver (3 pM)
   -------------------------
   
3. 上記SupplementaryTable2_changed.txtをさらに加工したデータ：
   NGSデータは(マイクロアレイの黎明期と同じく)金がかかりますので(technical and/or biological) replicatesを簡単には増やせませんので、「1サンプル vs. 1サンプル」比較の局面がまだまだあろうかと思います。 そこで、上記ファイルの2-6列目と7-11列目をそれぞれまとめた（総和をとった）ものSupplementaryTable2_changed2.txtです：
   
4. ABI_SOLiD/25-35bp/single-end/mouse (SRA000306; EB vs. ES) data (Cloonan et al., Nature Methods, 2008)
5. Illumina/50bp/paired-end/mouse (SRA012213; liver) data (Robertson et al., Nature Methods, 2010)
6. Illumina/35bp/single-end/human (SRA010153; MAQC) data (Bullard et al., BMC Bioinformatics, 2010)
7. Illumina/32bp/single-end/human (SRA000299; Liver vs. Kidney) data (Marioni et al., Genome Res., 2008)
8. NBPSeqパッケージ中のArabidopsisのBiological replicatesデータ(A群3サンプル vs. B群3サンプル)です。 オリジナルは"AT4G32850"というIDのものが重複して存在していたため、19520行目のデータを除去してタブ区切りテキストファイル(data_arab.txt)にしています。
   -------------------------
   2列目：mock1(A群)
   3列目：mock2(A群)
   4列目：mock3(A群)
   5列目：hrcc1(B群)
   6列目：hrcc2(B群)
   7列目：hrcc3(B群)
   -------------------------
   
9. ReCountデータベース
   マッピング済みの遺伝子発現行列形式のデータセットを多数提供しています。
   
   
10. Yeastの二群間比較用データ（2 mutant strains vs. 2 wild-types; technical replicates）
    7065行×4列のyeast RNA-seqデータ(data_yeast_7065.txt)
    R Console画面上で「library(yeastRNASeq)」と打ち込んでエラーが出る場合は、a.をコピペで実行してパッケージをインストールしましょう。
    このパッケージ中には他に、fastq形式ファイル(500,000 reads)と、bowtieでマッピング(unique mapping and allowing up to two mismatches)したBowtie形式ファイルがそれぞれ4ファイルずつあります。
    

    a. yeastRNASeqパッケージのインストール：
    ------    ここから    ------
    source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R")                 #おまじない
    biocLite("yeastRNASeq")                                          #yeastRNASeqパッケージのインストール
    
    ------    ここまで    ------
    
    b. yeastRNASeqパッケージがインストールされていれば以下のコピペでも取得可能：
    ------    ここから    ------
    library(yeastRNASeq)                                             #パッケージの読み込み
    data(geneLevelData)                                              #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているデータをロード
    dim(geneLevelData)                                               #行数と列数を表示
    head(geneLevelData)                                              #最初の数行を表示
    
    #ファイルに出力
    tmp <- cbind(rownames(geneLevelData), geneLevelData)             #geneLevelDataの「rownames情報(i.e., 遺伝子名)」と「カウントデータ」の行列を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "data_yeast_7065.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    
    ------    ここまで    ------
    

    BioconductorのyeastRNASeqのwebページ
    yeastRNASeq：Lee et al., PLoS Genet., 2008
    
    
11. 上記Yeastの二群間比較用データを用いてGC-content normalizationなどを行う場合に必要な情報
    yeast genes (SGD ver. r64)のGC含量(yeastGC_6717.txt)やlength情報(yeastLength_6717.txt)。
    R Console画面上で「library(EDASeq)」と打ち込んでエラーが出る場合は、a.をコピペで実行してパッケージをインストールしましょう。
    

    a. EDASeqパッケージのインストール：
    ------    ここから    ------
    source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R")                 #おまじない
    biocLite("EDASeq")                                               #EDASeqパッケージのインストール
    
    ------    ここまで    ------
    
    b. EDASeqパッケージがインストールされていれば以下のコピペでも取得可能：
    ------    ここから    ------
    library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み
    data(yeastGC)                                                    #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているyeastのGC含量情報をロード
    length(yeastGC)                                                  #要素数を表示
    head(yeastGC)                                                    #最初の数個を表示
    
    data(yeastLength)                                                #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているyeastの配列長情報をロード
    length(yeastLength)                                              #要素数を表示
    head(yeastLength)                                                #最初の数個を表示
    
    #それぞれ別々のファイルに出力
    tmp <- cbind(names(yeastGC), yeastGC)                            #yeastGCの「names属性情報」と「GC含量」のベクトルを列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "yeastGC_6717.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    tmp <- cbind(names(yeastLength), yeastLength)                    #yeastLengthの「names属性情報」と「配列長」のベクトルを列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "yeastLength_6717.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    
    ------    ここまで    ------
    

    BioconductorのEDASeqのwebページ
    EDASeq：Risso et al., BMC Bioinformatics, 2011
    
    
12. 「10.」と「11.」のファイルをもとに共通遺伝子(6685個)のみからなるのサブセットにしたファイル：
    (data_yeast_common_6685.txt; yeastGC_common_6685.txt; yeastLength_common_6685.txt)
    以下のコピペでも上記ファイルを得ることができます。
    

    ------    ここから    ------
    #必要なパッケージなどをロード
    library(yeastRNASeq)                                             #パッケージの読み込み
    library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み
    
    #count dataやGC含量情報(SGD ver. r64)の読み込みとラベル情報の作成
    data(geneLevelData)                                              #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているカウントデータ(geneLevelData)をロード
    data(yeastGC)                                                    #EDASeqパッケージ中で提供されているyeastのGC含量情報(yeastGC)をロード
    data(yeastLength)                                                #EDASeqパッケージ中で提供されているyeastの配列長情報(yeastLength)をロード
    
    #カウントデータ情報(geneLevelData)とGC含量情報(yeastGC)から共通して存在するサブセットを(同じ遺伝子名の並びで)取得
    common <- intersect(rownames(geneLevelData), names(yeastGC))     #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているデータをロード
    data <- as.data.frame(geneLevelData[common, ])                   #6685個の共通遺伝子分のカウントデータ行列をデータフレーム形式でdataに格納
    GC <- data.frame(GC = yeastGC[common])                           #6685個の共通遺伝子分のGC含量ベクトルをデータフレーム形式でGCに格納
    length <- data.frame(Length = yeastLength[common])               #6685個の共通遺伝子分の配列長ベクトルをデータフレーム形式でlengthに格納
    head(rownames(data))                                             #行列dataの行名(rownames)情報の最初の数個を表示
    head(rownames(GC))                                               #行列GCの行名(rownames)情報の最初の数個を表示
    head(rownames(length))                                           #行列lengthの行名(rownames)情報の最初の数個を表示
    
    #それぞれ別々のファイルに出力
    tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #「rownames情報」と「カウントデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "data_yeast_common_6685.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    tmp <- cbind(rownames(GC), GC)                                   #「rownames情報」と「GC含量情報」を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "yeastGC_common_6685.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    tmp <- cbind(rownames(length), length)                           #「rownames情報」と「配列長情報」を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "yeastLength_common_6685.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    
    ------    ここまで    ------
    

13. TCCパッケージ中のBiological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
    10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
    「G1_rep1, G1_rep2, G1_rep3, G2_rep1, G2_rep2, G2_rep3」の計6サンプル分からなります。
    全10,000遺伝子中の最初の2,000個(gene_1〜gene_2000まで)が発現変動遺伝子(DEG)です。
    全2,000 DEGsの内訳：最初の90%分(gene_1〜gene_1800)がG1群で4倍高発現、残りの10%分(gene_1801〜gene_2000)がG2群で4倍高発現
    R Console画面上で「library(TCC)」と打ち込んでエラーが出る場合は、a.をコピペで実行してパッケージをインストールしましょう。
    

    a. TCCパッケージのインストール：
    ------    ここから    ------
    install.packages("TCC", type = "source")                         #TCCパッケージのインストール
    
    ------    ここまで    ------
    
    b. TCCパッケージ(≥ ver. 1.1.99)がインストールされていれば以下のコピペでも取得可能：
    ------    ここから    ------
    library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み
    data(hypoData)                                                   #TCCパッケージ中で提供されているシミュレーションデータをロード
    
    #ファイルに出力
    tmp <- cbind(rownames(hypoData), hypoData)                       #「rownames情報」と「カウントデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "data_hypodata_3vs3.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    
    ------    ここまで    ------
    

14. 上記のTCCパッケージ中のBiological replicatesを模倣した「G1_rep1, G1_rep2, G1_rep3, G2_rep1, G2_rep2, G2_rep3」の計6サンプルからなるシミュレーションデータから、 1列目と4列目のデータを抽出した「複製なし」タグカウントデータ(data_hypodata_1vs1.txt)
    よって、「G1_rep1, G2_rep1」の計2サンプル分のみからなります。
    以下のコピペでも取得可能です。：
    

    ------    ここから    ------
    library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み
    data(hypoData)                                                   #TCCパッケージ中で提供されているシミュレーションデータをロード
    
    #ファイルに出力
    tmp <- cbind(rownames(hypoData), hypoData[, c(1, 4)])            #「rownames情報」と「カウントデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
    write.table(tmp, "data_hypodata_1vs1.txt", sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身を指定したファイル名で保存
    
    ------    ここまで    ------
    

• 会社名（買収される前の会社名）「製品名」
  
• Dover社など「POLONATOR G.007」
  
• Roche (454 Life Science) 「GS FLX+ System, GS Junior system」
  
• Illumina (Solexa)「 HiSeq 2000, HiSeq 1000, HiSeq SQ, Genome Analyzer IIx, MiSeq」
  
• Applied Biosystems (SOLiD) 「SOLiD 4 System, 5500 SOLiD System, 5500xl SOLiD System」
  
• Life Technologies (Ion Torrent)「Ion PGM sequencer」
  
• Helicos BioSciences 「Helicos Genetic Analysis Platform, HeliScope」
  
• Pacific Biosciences 「PacBio RS System」
  ...

• UCSCのSequence and Annotation Downloads
• Helix Systems Scientific Databases（アップデートの日付順になっている。RefSeqやESTなど様々なデータベースを一度にみられる）
• RefSeq
• RefSeqのHuman XX,XXX transcriptsのmulti-fastaファイル(結構頻繁にアップデートされているようですねX)
• RefSeqの"NM_"や"AC_"などの説明についてはこちら
• FASTA形式ファイル（Drosophila, E.coli, Human, Mouseなど）
• Human Genome Build 37 (hg19: ここでRefSeq genesの上流1000/2000/5000 bpの配列セットなども取得可能)

#step1:圧縮ファイルのダウンロード(確認したときときは46,352 transcriptsでした；解凍はどうにかしてやってください)
------    ここから    ------
in_f <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/human.rna.fna.gz"#欲しいファイルのURLを指定

hoge <- unlist(strsplit(in_f, "/", fixed=TRUE))                  #in_f中の文字列を"/"で分割した結果をhogeに保存
download.file(in_f, destfile=hoge[length(hoge)])                 #in_fで指定したURLのファイルをhoge[length(hoge)]で指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

#step2:本番
------    ここから    ------
in_f <- "human.rna.fna"                                          #解凍後のmulti-fastaファイルのファイル名human.rna.fnaを指定
out_f1 <- "hoge.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
hoge <- strsplit(names(reads), "|", fixed=TRUE)                  #names(reads)中の文字列を"|"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
refseq_with_v <- unlist(lapply(hoge, "[[", 4))                   #hogeのリスト中の4番目の要素(RefSeq accession number部分に相当)のみ抽出してrefseq_with_vに格納
hoge2 <- strsplit(refseq_with_v, ".", fixed=TRUE)                #refseq_with_v中の文字列を"."で区切った結果をリスト形式でhoge2に格納
refseq_without_v <- unlist(lapply(hoge2, "[[", 1))               #hoge2のリスト中の1番目の要素(RefSeq accession numberのバージョン番号でない部分に相当)のみ抽出してrefseq_without_vに格納

tmp <- cbind(refseq_without_v, width(reads))                     #「バージョン情報なしのRefSeq accession number (refseq_without_v)」と「配列長情報(width(reads))」を結合してtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#「webの11」に相当。tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#description部分をRefSeq accession number(バージョン番号つき)のみにしてFASTA形式で保存したい場合：
param1 <- 50                                                     #一行あたりの塩基数を指定
out_f2 <- "hoge.fasta"                                           #出力ファイル名を指定

reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを眺めているだけ(namesという列の部分がオリジナルのdescriptionのままになっていることがわかる)
names(reads) <- refseq_with_v                                    #names(reads)の中身をrefseq_with_vで置換(バージョン番号なしにしたければrefseq_without_vにすればいい)
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを眺めているだけ(namesという列の部分がrefseq_with_vでちゃんと置換されていることがわかる)
writeXStringSet(reads, file=out_f2, format="fasta", width=param1)#一行あたりの塩基数をparam1で指定した数にして、out_f2で指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

#param2で指定した配列長以上のもののみ抽出して保存したい場合：
param1 <- 70                                                     #一行あたりの塩基数を指定
param2 <- 200                                                    #配列長の閾値を指定
out_f3 <- "hoge2.fasta"                                          #出力ファイル名を指定

reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを眺めているだけ(namesという列の部分がrefseq_with_vでちゃんと置換されていることがわかる)
reads <- reads[width(reads) >= param2]                           #readsオブジェクト中のwidth(reads)で表される配列長がparam2以上のもののみ抽出してoutに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを眺めているだけ(配列数が減っているのがわかる)
writeXStringSet(reads, file=out_f3, format="fasta", width=param1)#一行あたりの塩基数をparam1で指定した数にして、out_f3で指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存


------    ここまで    ------

やり方1:
------    ここから    ------
in_f <- "l1-contigs.fa"                                          #multi-fastaファイルのファイル名を指定
param1 <- 300                                                    #配列長の閾値を指定
param2 <- 60                                                     #出力時の一行あたりの塩基数を指定

hoge <- unlist(strsplit(in_f, ".", fixed=TRUE))                  #in_f中の文字列を"."で分割した結果をhogeに保存
out_f <- paste(hoge[1], "_", param1, ".", hoge[2], sep="")       #出力ファイル名を自動生成

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

tmp <- readFASTA(in_f)                                           #in_fで指定したファイルをreadFASTA関数を用いて読み込み
tmp_desc <- unlist(lapply(tmp, "[[", 1))                         #tmpのリスト中の1番目の要素(description情報)のみ抽出してtmp_descに格納
tmp_seq <- unlist(lapply(tmp, "[[", 2))                          #tmpのリスト中の2番目の要素(配列情報)のみ抽出してtmp_seqに格納

reads <- DNAStringSet(tmp_seq)                                   #character vector形式の配列情報であるtmp_seqをDNAStringSetオブジェクト形式にしてreadsに格納
names(reads) <- tmp_desc                                         #readsオブジェクトのnamesのところにtmp_descの情報を代入
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
reads <- reads[width(reads) >= param1]                           #param1で指定した配列長以上のもののみ抽出してreadsに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=param2) #一行あたりの塩基数をparam2で指定した数にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

やり方2(別の関数をつかっているだけです):
------    ここから    ------
in_f <- "l1-contigs.fa"                                          #multi-fastaファイルのファイル名を指定
param1 <- 300                                                    #配列長の閾値を指定
param2 <- 60                                                     #出力時の一行あたりの塩基数を指定

hoge <- unlist(strsplit(in_f, ".", fixed=TRUE))                  #in_f中の文字列を"."で分割した結果をhogeに保存
out_f <- paste(hoge[1], "_", param1, ".", hoge[2], sep="")       #出力ファイル名を自動生成

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
tmp <- readFASTA(in_f)                                           #in_fで指定したファイルをreadFASTA関数を用いて読み込み
tmp_desc <- sapply(tmp, "[[", 1)                                 #tmpのリスト中の1番目の要素(description情報)のみ抽出してtmp_descに格納
tmp_seq <- sapply(tmp, "[[", 2)                                  #tmpのリスト中の2番目の要素(配列情報)のみ抽出してtmp_seqに格納

reads <- DNAStringSet(tmp_seq)                                   #character vector形式の配列情報であるtmp_seqをDNAStringSetオブジェクト形式にしてreadsに格納
names(reads) <- tmp_desc                                         #readsオブジェクトのnamesのところにtmp_descの情報を代入
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
reads <- reads[width(reads) >= param1]                           #param1で指定した配列長以上のもののみ抽出してreadsに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=param2) #一行あたりの塩基数をparam2で指定した数にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

やり方2に加えてdescription行を配列長のところまでの情報に制限したい場合:
------    ここから    ------
in_f <- "l1-contigs.fa"                                          #multi-fastaファイルのファイル名を指定
param1 <- 300                                                    #配列長の閾値を指定
param2 <- 60                                                     #出力時の一行あたりの塩基数を指定

hoge <- unlist(strsplit(in_f, ".", fixed=TRUE))                  #in_f中の文字列を"."で分割した結果をhogeに保存
out_f <- paste(hoge[1], "_", param1, ".", hoge[2], sep="")       #出力ファイル名を自動生成

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
tmp <- readFASTA(in_f)                                           #in_fで指定したファイルをreadFASTA関数を用いて読み込み
tmp_desc <- sapply(tmp, "[[", 1)                                 #tmpのリスト中の1番目の要素(description情報)のみ抽出してtmp_descに格納
tmp_seq <- sapply(tmp, "[[", 2)                                  #tmpのリスト中の2番目の要素(配列情報)のみ抽出してtmp_seqに格納

reads <- DNAStringSet(tmp_seq)                                   #character vector形式の配列情報であるtmp_seqをDNAStringSetオブジェクト形式にしてreadsに格納
tmp_desc <- chartr(":", " ", tmp_desc)                           #description情報に相当するtmp_desc中の":"を"_"に置換した結果をまたtmp_descに格納
hoge <- strsplit(tmp_desc, " ", fixed=TRUE)                      #tmp_desc中の文字列を" "で区切った結果をhogeに格納
names(reads) <- paste(sapply(hoge,"[[",1), sapply(hoge,"[[",2), sapply(hoge,"[[",3),sep="_")#readsオブジェクトのnamesのところにhogeの1-3番目までの要素を"_"で連結したものを代入
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
reads <- reads[width(reads) >= param1]                           #param1で指定した配列長以上のもののみ抽出してreadsに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=param2) #一行あたりの塩基数をparam2で指定した数にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

1. web経由(ver. 46)でやる場合（以下はコピペじゃありませんよ）：
------    ここから    ------
0. http://uswest.ensembl.org/Help/ArchiveListをクリック
1. Ensembl 46: Aug 2007のところをクリック
2. Mine Ensembl with BioMartのところをクリック
3. 「- CHOOSE DATABASE-」のプルダウンメニューから「Ensembl 46」を選択
4. 「- CHOOSE DATASET-」のプルダウンメニューから「Homo sapiens genes (NCBI36)」を選択
5. 左側にある青文字の「Attibutes」をクリック
6. 「GENE」の左側にある+の記号をクリック
7. 「Ensembl Gene ID」,「Ensembl Transcript ID」,「Ensembl CDS length」,「Ensembl cDNA length」にチェックを入れる
8. 「EXTERNAL」の左側にある+の記号をクリック
9. 「HGNC symbol」, 「RefSeq DNA ID」にチェックを入れる
10. 左上のほうにある「Results」のところをクリック
11. 「Go 」ボタンをクリックして好きなファイル名(例：ens_gene_46.txt)で保存
------    ここまで    ------
2. web経由(2011年8月15日現在の最新のバージョン)でやる場合（現状では、なぜか「Microsoft Internet Extensionで内部エラーが発生しました」などとなってファイルのダウンロードができません...）：
------    ここから    ------
1. BioMartをクリック
2. BioMart Central Portalのところをクリック
3. 「- CHOOSE DATABASE-」のプルダウンメニューから「Ensembl Genes 63 (SANGER UK)」を選択
4. 「- CHOOSE DATASET-」のプルダウンメニューから「Homo sapiens genes (GRCh37.p3)」を選択
5. 左側にある青文字の「Attibutes」をクリック
6. (デフォルトでは「Features」のところにチェックが入っている)「Sequences」のところにチェックを入れる
6. 「SEQUENCES」の左側にある+の記号をクリック
7. (デフォルトでは「Protein」のところにチェックが入っている)「cDNA sequences 」にチェックを入れる
8. 「Header Information 」の左側にある+の記号をクリック
9. 「Ensembl Gene ID」と「Ensembl Transcript ID」のみにチェックが入っていることを確認
10. 左上のほうにある「Results」のところをクリック
11. 「Unique results only」のところにチェックを入れて、 「Go 」ボタンをクリック
12. 好きなファイル名(例：ens_seq_63.txt)で保存
------    ここまで    ------

1. web経由(最新のバージョン)でやる場合（以下はコピペじゃありませんよ）：
------    ここから    ------
1. BioMartをクリック
2. Ensemblのところをクリック
3. 「- CHOOSE DATABASE-」のプルダウンメニューから「Ensembl Genes 60」を選択
4. 「- CHOOSE DATASET-」のプルダウンメニューから「Homo sapiens genes (GRCh37.p2)」を選択
5. 左側にある青文字の「Attibutes」をクリック
6. 「GENE」の左側にある+の記号をクリック
7. 「Ensembl Gene ID」,「Chromosome Name」,「Gene Start (bp)」,「Gene End (bp)」にチェックを入れる
8. 「EXTERNAL」の左側にある+の記号をクリック
9. 「HGNC symbol」にチェックを入れる
10. 左上のほうにある「Results」のところをクリック
11. 「Go 」ボタンをクリックして好きなファイル名(例：ens_gene_60.txt)で保存
------    ここまで    ------

2. Rでやる場合（以下は基本コピペですよ）：
------    ここから    ------
out_f <- "ens_gene_60_2.txt"                                     #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(biomaRt)                                                 #パッケージの読み込み

listMarts()                                                      #「webの1」に相当し、利用可能なデータベースを表示している（ここでこのライブラリ中での名前を把握しておく。例えばEnsemblは"ensembl"という名前になっていることが分かる）。
mart <- useMart("ensembl")                                       #「webの2」に相当
listDatasets(mart)                                               #「webの3」に相当
mart <- useDataset("hsapiens_gene_ensembl", mart=mart)           #「webの4」に相当
listFilters(mart)                                                #「webの?」に相当。特定の染色体上だけ、とか特定のマイクロアレイ上に搭載されたものだけ、などのフィルター(Filters)の条件を指定することができるが今回は何も指定していないので。。。
listAttributes(mart)                                             #「webの5-9」に相当。欲しい情報はそれぞれ"ensembl_gene_id", "chromosome_name", "start_position", "end_position", "hgnc_symbol"で取得可能であることが分かる（実際にはなかなかわかりずらいので、私はwebの表示順などから探し当てました。。。）
attr <- c("ensembl_gene_id", "chromosome_name", "start_position", "end_position", "hgnc_symbol")#「webの5-9」に相当
out <- getBM(attributes=attr, filters="", values="", mart=mart)  #「webの10」に相当
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#「webの11」に相当。outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

3. web経由(Ensemblの任意のversion)でやる場合（以下はコピペじゃありませんよ）：
------    ここから    ------
0. EnsemblのArchiveをクリック
1. 任意のバージョン(例えばEnsembl 48: Dec 2007)をクリック
2. 「Mine Ensembl with BioMart」をクリック
3. 「- CHOOSE DATABASE-」のプルダウンメニューから「Ensembl 48」を選択
4. 「- CHOOSE DATASET-」のプルダウンメニューから「Homo sapiens genes (NCBI36)」を選択
5. 左側にある青文字の「Attibutes」をクリック
6. 「GENE」の左側にある+の記号をクリック
7. 「Ensembl Gene ID」,「Chromosome Name」,「Gene Start (bp)」,「Gene End (bp)」にチェックを入れる
8. 「EXTERNAL」の左側にある+の記号をクリック
9. 「HGNC symbol」にチェックを入れる
10. 左上のほうにある「Results」のところをクリック
11. 「Unique results only」のところにチェックを入れて、 「Go 」ボタンをクリックして好きなファイル名(例：ens_gene_48.txt)で保存
------    ここまで    ------

4. Rでやる場合（対象がマウス：以下は基本コピペですよ）：
------    ここから    ------
out_f <- "ens_gene_60_mm.txt"                                    #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(biomaRt)                                                 #パッケージの読み込み

listMarts()                                                      #「webの1」に相当し、利用可能なデータベースを表示している（ここでこのライブラリ中での名前を把握しておく。例えばEnsemblは"ensembl"という名前になっていることが分かる）。
mart <- useMart("ensembl")                                       #「webの2」に相当
listDatasets(mart)                                               #「webの3」に相当
mart <- useDataset("mmusculus_gene_ensembl", mart=mart)          #「webの4」に相当
listFilters(mart)                                                #「webの?」に相当。特定の染色体上だけ、とか特定のマイクロアレイ上に搭載されたものだけ、などのフィルター(Filters)の条件を指定することができるが今回は何も指定していないので。。。
listAttributes(mart)                                             #「webの5-9」に相当。欲しい情報はそれぞれ"ensembl_gene_id", "chromosome_name", "start_position", "end_position", "mgi_curated_gene_symbol", "refseq_dna"で取得可能であることが分かる（実際にはなかなかわかりずらいので、私はwebの表示順などから探し当てました。。。また、mgi_gene_symbolなるものもあって、どれがより正確なのかは不明です）
attr <- c("ensembl_gene_id", "chromosome_name", "start_position", "end_position", "mgi_curated_gene_symbol", "refseq_dna")#「webの5-9」に相当
out <- getBM(attributes=attr, filters="", values="", mart=mart)  #「webの10」に相当
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#「webの11」に相当。outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. 目的のタブ区切りテキストファイル(annotation.txt)中の第1列目をキーとして、リストファイル(genelist1.txt)中のものが含まれる行全体を出力したい場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist1.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge1.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 1                                                       #in_f1で読み込む目的のファイルの何列目のデータに対してサーチしたいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t", quote="")       #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納
dim(data)                                                        #オブジェクトdataの行数と列数を表示

#本番
obj <- is.element(as.character(data[,param]), keywords)          #in_f1で読み込んだファイル中の(param)列目の文字列ベクトル中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるか含まれないか(TRUE or FALSE)の情報をobjに格納(集合演算をしている)
out <- data[obj,]                                                #行列dataからobjがTRUEとなる行のみを抽出した結果をoutに格納
dim(out)                                                         #オブジェクトoutの行数と列数を表示
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. 目的のタブ区切りテキストファイル(annotation.txt)中の第1列目をキーとして、リストファイル(genelist2.txt)中のものが含まれる行全体を出力したい場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist2.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 1                                                       #in_f1で読み込む目的のファイルの何列目のデータに対してサーチしたいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t", quote="")       #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番
obj <- is.element(as.character(data[,param]), keywords)          #in_f1で読み込んだファイル中の(param)列目の文字列ベクトル中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるか含まれないか(TRUE or FALSE)の情報をobjに格納(集合演算をしている)
out <- data[obj,]                                                #行列dataからobjがTRUEとなる行のみを抽出した結果をoutに格納
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

3. 目的のタブ区切りテキストファイル(annotation.txt)中の第3列目をキーとして、リストファイル(genelist2.txt)中のものが含まれる行全体を出力したい場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist2.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge3.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 3                                                       #in_f1で読み込む目的のファイルの何列目のデータに対してサーチしたいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t", quote="")       #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番
obj <- is.element(as.character(data[,param]), keywords)          #in_f1で読み込んだファイル中の(param)列目の文字列ベクトル中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるか含まれないか(TRUE or FALSE)の情報をobjに格納(集合演算をしている)
out <- data[obj,]                                                #行列dataからobjがTRUEとなる行のみを抽出した結果をoutに格納
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

4. 目的のタブ区切りテキストファイル(annotation.txt)に対して、リストファイル(genelist1.txt)中のものが含まれる行全体を出力したい場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist1.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge4.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番(リストファイル中の要素数分だけループを回して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得て、その行のみ出力)
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている
hoge <- NULL                                                     #最終的に欲しい行番号情報を格納するためのプレースホルダ
for(i in 1:length(keywords)){                                    #length(keywords)で表現される要素数分だけループを回す
    hoge <- c(hoge, c(grep(keywords[i], data)))                  #リストファイル中の要素ごとに検索をかけて要素中の文字列と一致する行番号情報をhogeにどんどん格納している
    if(i%%10 == 0) cat(i, "/", length(keywords), "finished\n")   #進行状況を表示させてるだけ
}
obj <- unique(hoge)                                              #得られるhogeベクトルは重複している可能性があるのでunique関数もかけた結果をobjに格納
out <- data[obj]                                                 #ベクトルdataからobjがTRUEとなる要素のみを抽出した結果をoutに格納(dataオブジェクトは行列ではないことに注意！)
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#リストファイル中にあるキーワードごとに、それが見つかった行番号情報を出力
out_f2 <- "hoge4_hoge.txt"                                       #出力ファイル名を指定
hoge2 <- NULL                                                    #欲しい行番号情報をリスト形式で格納するためのプレースホルダ
for(i in 1:length(keywords)){                                    #length(keywords)で表現される要素数分だけループを回す
    hoge2 <- c(hoge2, list(grep(keywords[i], data)))             #リストファイル中の要素ごとに検索をかけて要素中の文字列と一致する行番号情報を(キーワードごとに取り扱うため)リスト形式でhoge2にどんどん格納している
}
hoge3 <- sapply(hoge2, paste, collapse="\t")                     #hoge2はリスト形式になっているので、リストの各成分中の要素を"\t"で結合し、成分数が要素数になるようなベクトルhoge3を作成している(出力に用いるwriteLines関数がベクトル中の一要素を一行で出力する仕様になっている。それに合わせるための小細工です)
hoge4 <- paste(keywords, hoge3, sep="\t")                        #一番左側が検索に用いたリストファイル中のキーワードになるようなベクトルhoge4を作成
writeLines(hoge4, out_f2)                                        #hoge4の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

5. 目的のタブ区切りテキストファイル(annotation.txt)中の第1列目をキーとして、リストファイル(genelist1.txt)中のものに対応するannotation.txt中の第4列目(subcellular_location列)のみを出力する場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist1.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge5.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param1 <- 1                                                      #in_f1で読み込む目的のファイルの何列目のデータに対してサーチしたいかを指定
param2 <- 4                                                      #in_f1で読み込む目的のファイルの何列目のデータを出力したいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t", quote="")       #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番
obj <- is.element(as.character(data[,param1]), keywords)         #in_f1で読み込んだファイル中の(param1)列目の文字列ベクトル中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるか含まれないか(TRUE or FALSE)の情報をobjに格納(集合演算をしている)
out <- data[obj,param2]                                          #行列dataからobjがTRUEとなる行の(param2)列目の情報のみを抽出した結果をoutに格納
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

6. 4と同じことをsapply関数を用いてやる場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "annotation.txt"                                        #入力ファイル名(目的のタブ区切りテキストファイル)を指定
in_f2 <- "genelist1.txt"                                         #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge6.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番(リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得て、その行のみ出力)
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている
hoge <- sapply(keywords, grep, x=data)                           #リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得ている

obj <- unique(hoge)                                              #得られるhogeベクトルは重複している可能性があるのでunique関数をかけた結果をobjに格納
out <- data[obj]                                                 #ベクトルdataからobjがTRUEとなる要素のみを抽出した結果をoutに格納(dataオブジェクトは行列ではないことに注意！)
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

7. 6と同じことを別のファイルを用いてやる場合：
ラットのアノテーション情報ファイル(GPL1355-14795.txt), 二群間比較で発現変動が確認された遺伝子IDリストファイル(result_rankprod_BAT_id.txt)
------    ここから    ------
in_f1 <- "GPL1355-14795.txt"                                     #入力ファイル名(アノテーション情報ファイル)を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_id.txt"                            #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge7.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番(リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得て、その行のみ出力)
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている
hoge <- sapply(keywords, grep, x=data)                           #リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得ている

obj <- unique(hoge)                                              #得られるhogeベクトルは重複している可能性があるのでunique関数をかけた結果をobjに格納
out <- data[obj]                                                 #ベクトルdataからobjがTRUEとなる要素のみを抽出した結果をoutに格納(dataオブジェクトは行列ではないことに注意！)
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

8. 7と基本的には同じだが、「遺伝子IDリストファイル中の文字列」が「アノテーション情報ファイル中の一番左側」にしか存在しないという前提で高速に探索したい場合：
ラットのアノテーション情報ファイル(GPL1355-14795.txt), 二群間比較で発現変動が確認された遺伝子IDリストファイル(result_rankprod_BAT_id.txt)
------    ここから    ------
in_f1 <- "GPL1355-14795.txt"                                     #入力ファイル名(アノテーション情報ファイル)を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_id.txt"                            #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge8.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番(リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得て、その行のみ出力)
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている
hoge <- sapply(paste("^", keywords, sep=""), grep, x=data)       #リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得ている

obj <- unique(hoge)                                              #得られるhogeベクトルは重複している可能性があるのでunique関数をかけた結果をobjに格納
out <- data[obj]                                                 #ベクトルdataからobjがTRUEとなる要素のみを抽出した結果をoutに格納(dataオブジェクトは行列ではないことに注意！)
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

9. 8を基本として、8の出力ファイルは対象の行の情報全てを出力するものであったが、13列目のRefSeq Transcript IDに相当するもののみ抽出したい場合：
ラットのアノテーション情報ファイル(GPL1355-14795.txt), 二群間比較で発現変動が確認された遺伝子IDリストファイル(result_rankprod_BAT_id.txt)
------    ここから    ------
in_f1 <- "GPL1355-14795.txt"                                     #入力ファイル名(アノテーション情報ファイル)を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_id.txt"                            #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge9.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 13                                                      #in_f1で読み込むファイルの何列目のデータを出力したいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納

#本番(リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得て、その行のみ出力)
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている
hoge <- sapply(paste("^", keywords, sep=""), grep, x=data)       #リストファイル中の要素一つ一つに対して、要素中の文字列と一致する行番号情報を得ている

obj <- unique(hoge)                                              #得られるhogeベクトルは重複している可能性があるのでunique関数をかけた結果をobjに格納
hoge2 <- data[obj]                                               #ベクトルdataからobjがTRUEとなる要素のみを抽出した結果をhoge2に格納(dataオブジェクトは行列ではないことに注意！)
hoge3 <- strsplit(hoge2, "\t")                                   #hoge2ベクトル中の各要素を「タブ(\t)」で区切って分割した結果をhoge3に格納
out <- unlist(lapply(hoge3, "[[", param))                        #hoge3のリスト中の(param)番目の要素のみ抽出してoutに格納
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

10. 9を基本として、8の出力ファイルは対象の行の情報全てを出力するものであったが、13列目のRefSeq Transcript IDに相当するもののみ抽出したい場合：
ラットのアノテーション情報ファイル(GPL1355-14795.txt), 二群間比較で発現変動が確認された遺伝子IDリストファイル(result_rankprod_BAT_id.txt)
アノテーション情報ファイルの形式は"#"から始まる行以外は同じ列数なので、行列形式などにすることが可能なことを利用している（9に比べて一般性は劣るがより劇的に早い計算が可能）
------    ここから    ------
in_f1 <- "GPL1355-14795.txt"                                     #入力ファイル名(アノテーション情報ファイル)を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_id.txt"                            #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f <- "hoge10.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param <- 13                                                      #in_f1で読み込むファイルの何列目のデータを出力したいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでkeywordsに格納
keywords <- unique(keywords)                                     #リストファイル中の要素が重複している可能性があるので、重複なしの状態にしている

#アノテーション情報ファイル中で"#"から始まる行を除いて(param)列目の情報を抽出している
hoge <- grep("^#", data)                                         #正規表現で"#"から始まる行の位置情報を抽出してhogeに格納
data <- data[-hoge]                                              #ベクトルdataからhoge中の数値に対応する要素の除いた結果をdataに格納
hoge1 <- strsplit(data, "\t")                                    #dataベクトル中の各要素を「タブ(\t)」で区切って分割した結果をhoge1に格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge1, "[[", param))                      #hoge1のリスト中の(param)番目の要素のみ抽出してhoge2に格納
names(hoge2) <- unlist(lapply(hoge1, "[[", 1))                   #hoge1のリスト中の1番目の要素が遺伝子IDと対応するので、これをhoge2のnames属性として割り当てる

#本番(keywords中の要素に対応するRefSeq IDを取得)
hoge3 <- hoge2[keywords]                                         #hoge2ベクトルの中から、names(hoge2)がkeywordsと一致するものを抽出してhoge3に格納
out <- unique(hoge3)                                             #重複を除去している
writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

11. 10を基本として、遺伝子IDリストに対応するRefSeq Transcript IDを抽出ところまでは同じだが、RefSeq IDが同じで遺伝子IDリストにないもの(common)も存在するのでその分を考慮：
ラットのアノテーション情報ファイル(GPL1355-14795.txt), 二群間比較で発現変動が確認された遺伝子IDリストファイル(result_rankprod_BAT_id.txt)
アノテーション情報ファイルの形式は"#"から始まる行以外は同じ列数なので、行列形式などにすることが可能なことを利用している（9に比べて一般性は劣るがより劇的に早い計算が可能）
------    ここから    ------
in_f1 <- "GPL1355-14795.txt"                                     #入力ファイル名(アノテーション情報ファイル)を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_id.txt"                            #入力ファイル名(キーワードなどのリストファイル)を指定
out_f1 <- "result_rankprod_BAT_RefSeq_DEG.txt"                   #出力ファイル名1を指定
out_f2 <- "result_rankprod_BAT_RefSeq_nonDEG.txt"                #出力ファイル名2を指定
param <- 13                                                      #in_f1で読み込むファイルの何列目のデータを出力したいかを指定

#ファイルの読み込み
data <- readLines(in_f1)                                         #入力ファイル(目的のファイル)を読み込んでdataに格納
geneid_DEG <- readLines(in_f2)                                   #入力ファイル(リストファイル)を読み込んでgeneid_DEGに格納

#アノテーション情報ファイル中で"#"から始まる行を除いて(param)列目の情報を抽出している
hoge <- grep("^#", data)                                         #正規表現で"#"から始まる行の位置情報を抽出してhogeに格納
data <- data[-hoge]                                              #ベクトルdataからhoge中の数値に対応する要素の除いた結果をdataに格納
hoge1 <- strsplit(data, "\t")                                    #dataベクトル中の各要素を「タブ(\t)」で区切って分割した結果をhoge1に格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge1, "[[", param))                      #hoge1のリスト中の(param)番目の要素のみ抽出してhoge2に格納
names(hoge2) <- unlist(lapply(hoge1, "[[", 1))                   #hoge1のリスト中の1番目の要素が遺伝子IDと対応するので、これをhoge2のnames属性として割り当てる

#本番
tmp_DEG <- unique(hoge2[geneid_DEG])                             #hoge2ベクトルの中から、names(hoge2)がgeneid_DEGと一致するものを抽出し、重複を除いてtmp_DEGに格納
geneid_nonDEG <- setdiff(names(hoge2), geneid_DEG)               #読み込んだ遺伝子IDリストファイル中のID以外のものをgeneid_nonDEGに格納
tmp_nonDEG <- unique(hoge2[geneid_nonDEG])                       #hoge2ベクトルの中から、names(hoge2)がgeneid_nonDEGと一致するものを抽出し、重複を除いてtmp_nonDEGに格納

common <- intersect(tmp_DEG, tmp_nonDEG)                         #tmp_DEGとtmp_nonDEGベクトル間の積集合をcommonに格納
out_DEG <- setdiff(tmp_DEG, common)                              #tmp_DEGとcommon間の差集合をout_DEGに格納
out_nonDEG <- setdiff(tmp_nonDEG, common)                        #tmp_nonDEGとcommon間の差集合をout_nonDEGに格納

#ファイルに出力
writeLines(out_DEG, out_f1)                                      #out_DEGの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。
writeLines(out_nonDEG, out_f2)                                   #out_nonDEGの中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. 基本形(配列の生成のみ)：
------    ここから    ------
param1 <- 50                                                     #配列長を指定
narabi <- c("A","C","G","T")                                     #以下の数値指定時にACGTの並びを間違えないようにするために記述している（内部的にも使用してます）
param2 <- c(20, 30, 30, 20)                                      #(A,C,G,Tの並びで)各塩基の存在比率を指定

#param2で指定したACGTの比率で配列を生成しoutに格納するところ
ACGTset <- rep(narabi, param2)                                   #narabi中の塩基がparam2で指定した数だけ存在する文字列ベクトルACGTsetを作成
out <- paste(sample(ACGTset, param1, replace=T), collapse="")    #ACGTsetの文字型ベクトルからparam1回分だけ復元抽出して得られた塩基配列をoutに格納

------    ここまで    ------

2. 基本形(任意のdescription行つきのFASTA形式ファイルで保存)：
------    ここから    ------
param1 <- 50                                                     #配列長を指定
narabi <- c("A","C","G","T")                                     #以下の数値指定時にACGTの並びを間違えないようにするために記述している（内部的にも使用してます）
param2 <- c(20, 30, 30, 20)                                      #(A,C,G,Tの並びで)各塩基の存在比率を指定
param3 <- "kkk"                                                  #FASTA形式ファイルのdescription行に記述する内容
out_f <- "hoge2.fa"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#param2で指定したACGTの比率で配列を生成しoutに格納するところ
ACGTset <- rep(narabi, param2)                                   #narabi中の塩基がparam2で指定した数だけ存在する文字列ベクトルACGTsetを作成
out <- paste(sample(ACGTset, param1, replace=T), collapse="")    #ACGTsetの文字型ベクトルからparam1回分だけ復元抽出して得られた塩基配列をoutに格納

#param2で指定したACGTの比率で配列を生成
reads <- DNAStringSet(out)                                       #生成したoutオブジェクトはDNA塩基配列だと認識させるDNAStringSet関数を適用した結果をreadsに格納
names(reads) <- param3                                           #FASTA形式ファイルのdescription行に相当する記述を追加している
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=50)     #一行あたりの塩基数を「widthオプションで指定した数」にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

3. 任意の配列長をもつものを複数個作ってmulti-fastaファイルにしたい場合：
------    ここから    ------
param1 <- c(24, 103, 65)                                         #配列長を指定
narabi <- c("A","C","G","T")                                     #以下の数値指定時にACGTの並びを間違えないようにするために記述している（内部的にも使用してます）
param2 <- c(20, 30, 30, 20)                                      #(A,C,G,Tの並びで)各塩基の存在比率を指定
param3 <- "contig"                                               #FASTA形式ファイルのdescription行に記述する内容
out_f <- "hoge3.fa"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#param2で指定したACGTの比率で配列を生成
ACGTset <- rep(narabi, param2)                                   #narabi中の塩基がparam2で指定した数だけ存在する文字列ベクトルACGTsetを作成
out <- NULL                                                      #outというプレースホルダの作成
for(i in 1:length(param1)){                                      #length(param1)で表現される配列数分だけループを回す
    out <- c(out, paste(sample(ACGTset, param1[i], replace=T), collapse=""))#ACGTsetの文字型ベクトルからparam1[i]回分だけ復元抽出して得られた塩基配列をoutに格納
}

#DNAStringSetオブジェクト形式に変換してdescription情報を追加し、ファイルに出力するところ
reads <- DNAStringSet(out)                                       #生成したoutオブジェクトはDNA塩基配列だと認識させるDNAStringSet関数を適用した結果をreadsに格納
names(reads) <- paste(param3, 1:length(out), sep="_")            #FASTA形式ファイルのdescription行に相当する記述を追加している
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=50)     #一行あたりの塩基数を「widthオプションで指定した数」にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

4. 配列長情報を含むファイル(seq_length.txt; 中身は「24, 103, 65, 49」という四行からなる数値情報)を読み込む場合：
------    ここから    ------
in_f <- "seq_length.txt"                                         #読み込みたい配列長情報を含むファイルの名前を指定
narabi <- c("A","C","G","T")                                     #以下の数値指定時にACGTの並びを間違えないようにするために記述している（内部的にも使用してます）
param2 <- c(20, 30, 30, 20)                                      #(A,C,G,Tの並びで)各塩基の存在比率を指定
param3 <- "contig"                                               #FASTA形式ファイルのdescription行に記述する内容
out_f <- "hoge4.fa"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
param1 <- readLines(in_f)                                        #入力ファイル(in_fファイル)を読み込んでparam1に格納

#param2で指定したACGTの比率で配列を生成
ACGTset <- rep(narabi, param2)                                   #narabi中の塩基がparam2で指定した数だけ存在する文字列ベクトルACGTsetを作成
out <- NULL                                                      #outというプレースホルダの作成
for(i in 1:length(param1)){                                      #length(param1)で表現される配列数分だけループを回す
    out <- c(out, paste(sample(ACGTset, param1[i], replace=T), collapse=""))#ACGTsetの文字型ベクトルからparam1[i]回分だけ復元抽出して得られた塩基配列をoutに格納
}

#DNAStringSetオブジェクト形式に変換してdescription情報を追加し、ファイルに出力するところ
reads <- DNAStringSet(out)                                       #生成したoutオブジェクトはDNA塩基配列だと認識させるDNAStringSet関数を適用した結果をreadsに格納
names(reads) <- paste(param3, 1:length(out), sep="_")            #FASTA形式ファイルのdescription行に相当する記述を追加している
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta", width=50)     #一行あたりの塩基数を「widthオプションで指定した数」にして、out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

1. n=3として、4^n = 4^3 = 64通りの3塩基からなる可能な配列を作成したい場合：
------    ここから    ------
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
param <- 3                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

out <- mkAllStrings(c("A", "C", "G", "T"), param)                #(param)連続塩基の全ての可能な配列情報をoutに格納

writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. n=5として、4^n = 4^5 = 1024通りの5塩基からなる可能な配列を作成したい場合：
------    ここから    ------
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 5                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

out <- mkAllStrings(c("A", "C", "G", "T"), param)                #(param)連続塩基の全ての可能な配列情報をoutに格納

writeLines(out, out_f)                                           #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "NM_006256"                                            #取得したい配列のアクセッション番号を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(GeneR)                                                   #パッケージの読み込み

------    ここまで    ------

1. sample1.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "sample1.fasta"                                          #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp1.fasta"                                            #出力ファイル名を指定
param <- c(3, 9)                                                 #抽出したい範囲の始点と終点を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- subseq(reads, param[1], param[2])                         #paramで指定した始点と終点の範囲の配列を抽出してoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

2. h_rna.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp2.fasta"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- "NM_203348.1"                                          #取得したい配列のアクセッション番号を指定
param2 <- c(2, 5)                                                #抽出したい範囲の始点と終点を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
head(reads)                                                      #readsオブジェクトの最初の一部を表示(ちなみに最後の一部を表示させたい場合は「tail(reads)」)
names(reads)                                                     #readsオブジェクトのID (description部分)を表示させたい場合
obj <- names(reads) == param1                                    #param1で指定したIDの配列の位置情報（TRUE or FALSE）をobjに格納
out <- subseq(reads[obj], param2[1], param2[2])                  #objがTRUEとなる塩基配列のもののみに対して、param2で指定した始点と終点の範囲の配列を抽出してoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

3. h_rna.fastaファイルで抽出したい情報をリストファイル（list_sub1.txt）で与える場合:
------    ここから    ------
in_f1 <- "h_rna.fasta"                                           #multi-fasta形式のファイルを指定
in_f2 <- "list_sub1.txt"                                         #リストファイルを指定
out_f <- "tmp3.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                 #in_f1で指定したファイルをFASTA形式で読み込み
list_obj <- read.table(in_f2)                                    #in_f2で指定したファイルの読み込み

out <- NULL                                                      #最終的に得る結果を格納するためのプレースホルダoutを作成しているだけ
for(i in 1:nrow(list_obj)){                                      #length(list_obj)回だけループを回す
    obj <- names(reads) == list_obj[i,1]                         #names(reads)中でlist_obj[i,1]と一致する位置をTRUE、それ以外をFALSEとしたベクトルobjを作成
    out <- append(out, subseq(reads[obj], start=list_obj[i,2], end=list_obj[i,3]))#subseq関数を用いてobjがTRUEとなるもののみに対して、list_obj[i,2]とlist_obj[i,3]で与えた範囲に対応する部分配列を抽出した結果をoutにどんどん格納している
}                                                                #
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

4. hoge4.faファイルで抽出したい情報をリストファイル（list_sub2.txt）で与える場合:
------    ここから    ------
in_f1 <- "hoge4.fa"                                              #multi-fasta形式のファイルを指定
in_f2 <- "list_sub2.txt"                                         #リストファイルを指定
out_f <- "tmp4.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                 #in_f1で指定したファイルをFASTA形式で読み込み
list_obj <- read.table(in_f2)                                    #in_f2で指定したファイルの読み込み

out <- NULL                                                      #最終的に得る結果を格納するためのプレースホルダoutを作成しているだけ
for(i in 1:nrow(list_obj)){                                      #nrow(list_obj)回だけループを回す
    obj <- names(reads) == list_obj[i,1]                         #names(reads)中でlist_obj[i,1]と一致する位置をTRUE、それ以外をFALSEとしたベクトルobjを作成
    out <- append(out, subseq(reads[obj], start=list_obj[i,2], end=list_obj[i,3]))#subseq関数を用いてobjがTRUEとなるもののみに対して、list_obj[i,2]とlist_obj[i,3]で与えた範囲に対応する部分配列を抽出した結果をoutにどんどん格納している
}                                                                #
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

#例1：sample1.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "sample1.fasta"                                          #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp2.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- translate(reads)                                          #readsをアミノ酸配列に翻訳したものをoutに格納
names(out) <- names(reads)                                       #現状では翻訳した結果のオブジェクトoutのdescription行が消えてしまうようなので、description部分の情報に相当するnames(reads)をnames(out)に格納している
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------
#例2：h_rna.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp2.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- translate(reads)                                          #readsをアミノ酸配列に翻訳したものをoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

#例1：sample1.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "sample1.fasta"                                          #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp3.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- complement(reads)                                         #readsオブジェクトの相補鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------
#例2：h_rna.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp3.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- complement(reads)                                         #readsオブジェクトの相補鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

#例1：sample1.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "sample1.fasta"                                          #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp4.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- reverseComplement(reads)                                  #readsオブジェクトの逆相補鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------
#例2：h_rna.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp4.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- reverseComplement(reads)                                  #readsオブジェクトの逆相補鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

#例1：sample1.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "sample1.fasta"                                          #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp4.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- reverse(reads)                                            #readsオブジェクトの逆鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------
#例2：h_rna.fastaファイルの場合
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "tmp4.fasta"                                            #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- reverse(reads)                                            #readsオブジェクトの逆鎖をoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

1. hoge4.faファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge1.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- dinucleotideFrequency(reads)                              #二連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. h_rna.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- dinucleotideFrequency(reads)                              #二連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. hoge4.faファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge1.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- trinucleotideFrequency(reads)                             #三連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. h_rna.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- trinucleotideFrequency(reads)                             #三連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. hoge4.faファイルで4連続塩基（n=4）の出現頻度情報がほしい場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge1.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 4                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- oligonucleotideFrequency(reads, width=param)              #(param)連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. hoge4.faファイルで2連続塩基（n=2）の出現頻度情報がほしい場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 2                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- oligonucleotideFrequency(reads, width=param)              #(param)連続塩基の出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(reads), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

3. hoge4.faファイルで2連続塩基（n=2）の全コンティグをまとめた出現頻度情報がほしい場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge3.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 2                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- oligonucleotideFrequency(reads, width=param, simplify.as="collapsed")#(param)連続塩基の全コンティグをまとめた出現頻度情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(out), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

4. hoge4.faファイルで2連続塩基（n=2）の全コンティグをまとめた出現確率情報がほしい場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge4.txt"                                             #出力ファイル名を指定
param <- 2                                                       #欲しい連続塩基の長さ情報を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
out <- oligonucleotideFrequency(reads, width=param, simplify.as="collapsed", as.prob=TRUE)#(param)連続塩基の全コンティグをまとめた出現確率情報をoutに格納

tmp <- cbind(names(out), out)                                  #最初の列にID情報、そのあとに出現頻度情報のoutを結合したtmpを作成
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

• NCBI Sequence Read Archive (SRA)
• DDBJ Sequence Read Archive (DRA)
• European Nucleotide Archive (ENA)

------    ここから    ------
param <- "SRX016359"                                             #accession番号を指定してparamに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(SRAdb)                                                   #パッケージの読み込み

sqlfile <- getSRAdbFile()                                        #おまじない(SRAmetadb.sqliteファイルを取得してsqlfileというオブジェクト名とする)
file.info(sqlfile)                                               #おまじない(sqlfileの中身を表示させてるだけ)
sra_con <- dbConnect(SQLite(), sqlfile)                          #おまじない
rs <- listSRAfile(in_acc=param, sra_con=sra_con)                 #paramで指定したexperimentのaccessionから得られる"SRR"から始まるrunのaccession番号のURL情報を取得して、rsというオブジェクト名とする
for(i in 1:length(rs$sra)){                                      #"SRR"のアクセッション番号分だけループを回す
    hoge <- unlist(strsplit(rs$sra[[i]], "/", fixed=TRUE))       #URLの文字列を"/"で分割した結果をhogeに保存
    cat('downloading(',i, "/", length(rs$sra), ')', hoge[length(hoge)], "\n", sep="")#状況を表示
    download.file(rs$sra[[i]], destfile=hoge[length(hoge)])      #rs$sra[[i]]で指定したURLのファイルをhoge[length(hoge)]で指定したファイル名で保存
}

param <- "SRX016367"                                             #accession番号を指定してparamに格納
sqlfile <- getSRAdbFile()                                        #おまじない(SRAmetadb.sqliteファイルを取得してsqlfileというオブジェクト名とする)
file.info(sqlfile)                                               #おまじない(sqlfileの中身を表示させてるだけ)
sra_con <- dbConnect(SQLite(), sqlfile)                          #おまじない
rs <- listSRAfile(in_acc=param, sra_con=sra_con)                 #paramで指定したexperimentのaccessionから得られる"SRR"から始まるrunのaccession番号のURL情報を取得して、rsというオブジェクト名とする
for(i in 1:length(rs$sra)){                                      #"SRR"のアクセッション番号分だけループを回す
    hoge <- unlist(strsplit(rs$sra[[i]], "/", fixed=TRUE))       #URLの文字列を"/"で分割した結果をhogeに保存
    cat('downloading(',i, "/", length(rs$sra), ')', hoge[length(hoge)], "\n", sep="")#状況を表示
    download.file(rs$sra[[i]], destfile=hoge[length(hoge)])      #rs$sra[[i]]で指定したURLのファイルをhoge[length(hoge)]で指定したファイル名で保存
}

------    ここまで    ------

• Bowtie (Langmead et al., Genome Biol., 2009)
  ・OS：Linux, Windows(32bit), and Mac
  ・入力ファイル：FASTA and FASTQ
  ・オプション例1：「--offrate 3 -p 8 -v 0 -k 10000 --sam」
  ・オプション例1の説明："--offrate 3"とすることでdefaultの5よりもメモリをより多く消費するが高速化させている。"-p 8"で8コア使え。"-v 0"でミスマッチ数は0。"-k 10000"でreadあたり最大10000 valid alignmentsまで出力せよ。("-v 0"としてあるので、"--best"をわざわざ与えなくてもいいはず)
  ・オプション例2：「--offrate 3 -p 8 -v 2 --best -k 100 --sam」
  ・オプション例2の説明："-v 2"でミスマッチ数は2。"--best"で最もミスマッチ数が少なかったものだけを出力せよ。"-k 100"でreadあたり最大100 valid alignmentsまで出力せよ。"--sam"でSAM formatで出力せよ。
  ・オプション例3：「--offrate 3 -p 8 -v 2 -k 1 --sam」
  ・オプション例3の説明："-v 2"でミスマッチ数は2個まで許容し、"-k 1"でreadあたり上位1つだけのvalid alignmentsを出力せよ。
  ・オプション例4：「--offrate 3 -p 8 -a --best --strata -v 2 -m 1」
  ・オプション例4の説明："-v 2"でミスマッチ数は2個まで許容する、としつつも"-a --best --strata"で最小のミスマッチ数でヒットした結果のみ全て出力せよ、としつつも"-m 1"で1か所にしかヒットしないものだけを出力せよ。おそらくこれは「SOAP2のオプション例3」あたりに相当します。
  ・オプション例5：「--offrate 3 -p 8 -a -v 2 -m 1」
  ・オプション例5の説明：例4との違いは"--best --strata"があるかないか。これがない場合は、readあたりのreportable alignments数が増えるので結果的に"-m 1"の条件で落とされるものが増える。したがって例4のほうが例5よりもレポートするread数が多くなる。
  ・オプション例6：「-v 0 -a -maxins 250」
  ・オプション例6の説明："-v 0"でミスマッチ数は0 (つまりperfect matchのみ)。"-a"で全てのマップされた座標情報を出力せよ。"-maxins 250"でcDNAフラグメントサイズが250 bpまでの可能性を考えろ(これは36-bp pair-end dataの場合；ちなみに50-bp pair-end dataの場合は"-maxins 400"と指定、するのがいい？！)。
  ・出力形式：Bowtie and SAM format
  
• BWA (Li and Durbin, Bioinformatics, 2009(BWA-shortの論文))
  ・OS：Linux and Mac
  ・入力ファイル：FASTQ (少なくとも)
  ・オプション例：「-n 10000」
  ・出力形式：SAM format
  ・その他：現在では、こちらはBWA-shortというものに相当します。200bp塩基以下の長さのreadをqueryにするときは、BWA-shortを使うようです。上記の2009年の論文のときはBWAという名前でしたが、2010年にBWA-SWというlong-read用のものが出たので、これら二つの総称がBWAで、2009年のものをBWA-short, 2010年のものをBWA-SWとしたようですね。
  
• BWA (Li and Durbin, Bioinformatics, 2010(BWA-SWの論文))
  ・OS：
  ・入力ファイル：
  ・オプション例：
  ・出力形式：
  ・その他：BWA-SWのSWはSmith-Watermanの略です。BWA-shortと対比させて、queryが200bpよりも長く100kbp程度以下の長さのアラインメントの際に用いるようです。 競合するプログラムとしては、BLAT (Kent WJ, Genome Res., 2002)やSSAHA2 (Ning et al., Genome Res., 2001)があります。精度的な面では、BLATよりも高精度でSSHAと同程度とabstractには書いてありますね。
  
• ELAND (Illumina's commercial alignment program)
  
• MAQ (Li et al., Genome Res., 2008)
  ・OS：Linux
  
• MOM (Eaves and Gao, Bioinformatics, 2009)
  ・OS：Linux
  
• Novoalign (Krawitz et al., Bioinformatics, 2010)
  ・OS：Linux and Mac
  ・出力形式：SAM format
  
• PASS (Campagna et al., Bioinformatics, 2009)
  ・OS：Linux and Windows (X86 and AMD64; 意味不明)
  ・入力ファイル：FASTA (FASTQもOKと書いてあるがだめでした...)
  ・アダプター配列除去：No
  ・オプション例：「-fid 100 -max_best_hits 10000 -pst ~/pass_v1.01/PST/W5M1m0G0X0.pst 9 -b -gff -info_gff」
  ・出力形式：GFF3 format
  
• PatMaN (Prufer et al., Bioinformatics, 2008)
  ・OS：Linux
  
• RazerS (Weese et al., Genome Res., 2009)
  ・OS：Linux
  
• RMAP (Smith et al., BMC Bioinformatics, 2008)
  ・OS：Linux
  ・入力ファイル：FASTA and FASTQ
  
• SHRiMP (Rumble et al., PLoS Comput. Biol., 2009)
  ・OS：Linux and Mac
  
• SOAP1 (Li et al., Bioinformatics, 2008)
  ・OS：Linux
  ・入力ファイル：FASTA and FASTQ
  ・アダプター配列除去：Yes
  ・出力形式：SOAP format
  
• SOAP2 (Li et al., Bioinformatics, 2009)
  ・OS：Linux and Mac
  ・入力ファイル：FASTA and FASTQ
  ・アダプター配列除去：No
  ・オプション例1：「-M 0 -r 2 -n 0」
  ・オプション例1の説明：ミスマッチが0個で、multiple best hitsのものに対しては全部出力(最大10000)で、Nを全く含まない配列のみ
  ・オプション例2：「-M 4 -r 0 -n 0」
  ・オプション例2の説明："-M 4"は、ミスマッチが2個以下という条件の中でベストヒットを探せ。"-r 0"はmultiple best hitsのものは出力しない(つまり、一か所にしかヒットしないものだけを出力せよ)。
  ・オプション例3：「-M 4 -r 0 -n 2」
  ・オプション例3の説明："-M 4"は、ミスマッチが2個以下という条件の中でベストヒットを探せ。"-r 0"はmultiple best hitsのものは出力しない(つまり、一か所にしかヒットしないものだけを出力せよ)。"-n 2"はread中にNを2個含むものまで許容。おそらくこれは「Bowtieのオプション例4」あたりに相当します。
  ・出力形式：SOAP format (SOAP --> SAMへの変換プログラムあり；soap2sam.pl)
  
• ZOOM (Lin et al., Bioinformatics, 2008)
  
• ZOOM Lite (Zhang et al., Nucleic Acids Res., 2010)
  ・OS：Linux and Windows
  ・入力ファイル：FASTA, FASTQ, Illuminaの*_seq.txtと*_prb.txt, SOLiDの*.csfastaと*_QV.qualと*.csfastq
  ・Platform：Illumina and ABI
  ・出力形式：ZOOM, SAM, BED, and GFF format
  

• BLAT (Kent WJ, Genome Res., 2002)
  ・その他：seed-and-extend aligner
  
• QPALMA (De Bona et al., Bioinformatics, 2008)
  
• TopHat (Trapnell et al., Bioinformatics, 2009)
  ・OS：Linux and Mac
  ・入力ファイル：FASTA and FASTQ
  ・出力形式：SAM format
  ・その他：リードあたり75bpで最適化しているようだ。Illumina and ABI SOLiD。Burrows-Wheeler Transform (BWT) aligner
  
• RNA-MATE (Cloonan et al., Bioinformatics, 2009)
  
• GSNAP (Wu et al., Bioinformatics, 2010)
  ・その他：seed-and-extend aligner
  
• SpliceMap (Au et al., Nucleic Acids Res., 2010)
  
• MapSplice (Wang et al., Nucleic Acids Res., 2010)
  
• HMMSplicer (Dimon et al., PLoS One, 2010)
  
• X-MATE (Wood et al., Bioinformatics, 2011)
  ・その他：RNA-MATEのアップデート版です
  
• RNASEQR (Chen et al., Nucleic Acids Res., 2012)
  
• PASSion (Zhang et al., Bioinformatics, 2012)
  
• ContextMap (Bonfert et al., BMC Bioinformatics, 2012)
  

---  SRR037439.fastq  ---
@SRR037439.1 HWI-E4_6_30ACL:2:1:0:176 length=35
NNNNNNNNNNNNNNNCTACCCCCCCAGCCGCCGCA
+SRR037439.1 HWI-E4_6_30ACL:2:1:0:176 length=35
!!!!!!!!!!!!!!!""""""""""""""""#"""
@SRR037439.2 HWI-E4_6_30ACL:2:1:0:252 length=35
NNNNNNNNNNNNNNNAGACAGTTGATTTAGCATAG
+SRR037439.2 HWI-E4_6_30ACL:2:1:0:252 length=35
!!!!!!!!!!!!!!!"+"""""""""""""""""&
@SRR037439.3 HWI-E4_6_30ACL:2:1:0:1152 length=35
NNNNNNNNNNNNNNNGGGTGGGGCGTTTGTTCTT

---  fastq_process.plをかけた後のSRR037439.fastq2  ---
@SRR037439.1
NNNNNNNNNNNNNNNCTACCCCCCCAGCCGCCGCA
+SRR037439.1
!!!!!!!!!!!!!!!""""""""""""""""#"""
@SRR037439.2
NNNNNNNNNNNNNNNAGACAGTTGATTTAGCATAG
+SRR037439.2
!!!!!!!!!!!!!!!"+"""""""""""""""""&
@SRR037439.3
NNNNNNNNNNNNNNNGGGTGGGGCGTTTGTTCTTG

---  fastq_process2.plをかけた後のSRR037439.fastq2  --- 
@1
NNNNNNNNNNNNNNNCTACCCCCCCAGCCGCCGCA
+1
!!!!!!!!!!!!!!!""""""""""""""""#"""
@2
NNNNNNNNNNNNNNNAGACAGTTGATTTAGCATAG
+2
!!!!!!!!!!!!!!!"+"""""""""""""""""&
@3
NNNNNNNNNNNNNNNGGGTGGGGCGTTTGTTCTTG 

------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_2.fastq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
out <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(sapply(hoge,"[[", 1)))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

• BED format
  
• ELAND format
• GFF (General Feature Format) format
  
• GFF3 (General Feature Format ver.3) format
  
• SAM (Sequence Alignment/Map) format (Li et al., Bioinformatics, 2009)
  
• SOAP format
• ZOOM format

• BAM --> BED：BEDToolsのbamToBedで可能
  
• SAM <--> BAM：SAMtoolsで可能
  
• SOAP --> SAM：soap2sam.plというperlプログラムで可能
  
• SAM --> BED：sam2bed.plというperlプログラムで可能
  
• qseq --> fastq：qseq2fastq.plというperlプログラムで可能(ファイルの読み込み | マップ前 | Illuminaの*_qseq.txtでも可能)
  
• lite.sra --> fastq：SRA Toolkit中のfastq-dumpというコマンドで可能
  

• ADiR (Applied Biosystems)
  
• Velvet (Zerbino and Birney, Genome Res., 2008)
  
• SHORTY (Hossain et al., BMC Bioinformatics, 2009)
  
• ABySS (Simpson et al., Genome Res., 2009)
  

• Phusion (Mullikin and Ning, Genome Res., 2003)
  
• SSAKE (Warren et al., Bioinformatics, 2007)
  
• VCAKE (Jeck et al., Bioinformatics, 2007)
  
• SHARCGS (Dohm et al., Genome Res., 2007)
  
• Edena (bacteria程度用か!?; single-end and uniform length only?!) (Hernandez et al., Genome Res., 2008)
  
• Velvet (Zerbino and Birney, Genome Res., 2008)
  
• EULER-SR (Chaisson et al., Genome Res., 2009)
  
• ABySS (Simpson et al., Genome Res., 2009)
  
• Taipan (Schmidt et al., Bioinformatics, 2009)
  
• MIRA (Diguistini et al., Genome Biol., 2009)
  
• ALLPATHS-LG (Maccallum et al., Genome Biol., 2009)
  
• SOAPdenovo (Li et al., Genome Res., 2010)
  
• Platanus (論文はまだ？！)
  

• Phusion (Mullikin and Ning, Genome Res., 2003)
  
• PCAP (Huang et al., Genome Res., 2003)
  
• Newbler (Margulies et al., Nature, 2005)
  
• Velvet (Zerbino and Birney, Genome Res., 2008)
  
• CABOG (Miller et al., Bioinformatics, 2008)
  
• EULER-SR (Chaisson et al., Genome Res., 2009)
  
• ABySS (Simpson et al., Genome Res., 2009)
  
• MIRA (Diguistini et al., Genome Biol., 2009)
  

• Minimus (Sommer et al., BMC Bioinformatics, 2007)
  
• Mapsembler (Peterlongo and Chikhi, BMC Bioinformatics, 2012)
  

• Oases ((Schulz et al., Bioinformatics, 2012))
  

• Multiple-k (Surget-Groba and Montoya-Burgos, Genome Res., 2010)
  
• Trans-ABySS (Robertson et al., Nature Methods, 2010; v1.2.0のマニュアル)
  
• Rnnotator (欲しければ著者にメールか?!) (Martin et al., BMC Genomics, 2010)
  
• Trinity (Grabherr et al., Nature Biotechnol, 2011)
  
• Oases ((Schulz et al., Bioinformatics, 2012))
  

• Oases ((Schulz et al., Bioinformatics, 2012))
  

• Scripture (Guttman et al., Nature Biotechnol., 2010)
  
• Cufflinks (Trapnell et al., Nature Biotechnol., 2010)
  
• STM (Surget-Groba and Montoya-Burgos, Genome Res., 2010)
  
• ALEXA-seq (Griffith et al., Nat Methods, 2010)
  
• ARTADE2 (Kawaguchi et al., Bioinformatics, 2012)
  
• Plntron (Pirola et al., BMC Bioinformatics, 2012)
  

1. hoge4.faファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge1.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み

Total_length <- sum(width(reads))                                #コンティグの「トータルの長さ」の情報を取得
Number_of_contigs <- length(reads)                               #「コンティグ数」の情報を取得
Average_length <- mean(width(reads))                             #コンティグの「平均長」の情報を取得
Median_length <- median(width(reads))                            #コンティグの「中央値」の情報を取得
Max_length <- max(width(reads))                                  #コンティグの長さの「最大値」の情報を取得
Min_length <- min(width(reads))                                  #コンティグの長さの「最小値」の情報を取得

#N50計算のところ
sorted_length <- rev(sort(width(reads)))                         #長さ情報を降順にソートした結果をsorted_lengthに格納
N50 <- sorted_length[cumsum(sorted_length) >= Total_length/2][1] #「N50」(長いものから足しこんでいってTotal_lengthの半分に達したときのコンティグの長さ、のこと)の情報を取得

#GC含量(GC content)計算のところ
count <- alphabetFrequency(reads)                                #A,C,G,T,..の数を各配列ごとにカウントした結果をcountに格納
CG <- rowSums(count[,2:3])                                       #C,Gの総数を計算してCGに格納
ACGT <- rowSums(count[,1:4])                                     #A,C,G,Tの総数を計算してACGTに格納
GC_content <- sum(CG)/sum(ACGT)                                  #トータルのGC含量の情報を取得

#出力用に結果をまとめている
tmp <- NULL
tmp <- rbind(tmp, c("Total length (bp)", Total_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Number of contigs", Number_of_contigs))
tmp <- rbind(tmp, c("Average length", Average_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Median length", Median_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Max length", Max_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Min length", Min_length))
tmp <- rbind(tmp, c("N50", N50))
tmp <- rbind(tmp, c("GC content", GC_content))
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. h_rna.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み

Total_length <- sum(width(reads))                                #コンティグの「トータルの長さ」の情報を取得
Number_of_contigs <- length(reads)                               #「コンティグ数」の情報を取得
Average_length <- mean(width(reads))                             #コンティグの「平均長」の情報を取得
Median_length <- median(width(reads))                            #コンティグの「中央値」の情報を取得
Max_length <- max(width(reads))                                  #コンティグの長さの「最大値」の情報を取得
Min_length <- min(width(reads))                                  #コンティグの長さの「最小値」の情報を取得

#N50計算のところ
sorted_length <- rev(sort(width(reads)))                         #長さ情報を降順にソートした結果をsorted_lengthに格納
N50 <- sorted_length[cumsum(sorted_length) >= Total_length/2][1] #「N50」(長いものから足しこんでいってTotal_lengthの半分に達したときのコンティグの長さ、のこと)の情報を取得

#GC含量(GC content)計算のところ
count <- alphabetFrequency(reads)                                #A,C,G,T,..の数を各配列ごとにカウントした結果をcountに格納
CG <- rowSums(count[,2:3])                                       #C,Gの総数を計算してCGに格納
ACGT <- rowSums(count[,1:4])                                     #A,C,G,Tの総数を計算してACGTに格納
GC_content <- sum(CG)/sum(ACGT)                                  #トータルのGC含量の情報を取得

#出力用に結果をまとめている
tmp <- NULL
tmp <- rbind(tmp, c("Total length (bp)", Total_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Number of contigs", Number_of_contigs))
tmp <- rbind(tmp, c("Average length", Average_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Median length", Median_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Max length", Max_length))
tmp <- rbind(tmp, c("Min length", Min_length))
tmp <- rbind(tmp, c("N50", N50))
tmp <- rbind(tmp, c("GC content", GC_content))
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

• GenomeGraphs (Durinck et al., BMC Bioinformatics, 2009)
  
• HilbertVis (Anders S., Bioinformatics, 2009)
  
• rtracklayer (Lawrence et al., Bioinformatics, 2009)
  
• TileQC (Dolan and Denver, BMC Bioinformatics, 2008; Illumina用; どこにあるかわかりません。。。)
  

• EagleView (Huang and Marth, Genome Res., 2008)
  ・OS：Linux and Windows, and Mac
  
• MagicViewer (Hou et al., Nucleic Acids Res., 2010)
  ・OS：Linux and Windows, and Mac
  
• MapView (Bao et al., Bioinformatics, 2009)
  ・OS：Linux and Windows
  
• NGSView (Arner et al., Bioinformatics, 2010)
  ・OS：Linux
  
• Tablet (Milne et al., Bioinformatics, 2010)
  ・OS：Linux and Windows, and Mac
  
• ZOOM Lite (Zhang et al., Nucleic Acids Res., 2010)
  ・OS：Linux and Windows
  

1. readDNAStringSet関数を用いた場合（quality情報は読み込まれない）：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fastq")                  #in_fで指定したファイルの読み込み
reads                                                            #readsの中身を表示

------    ここまで    ------

2. readFastq関数を用いてquality情報も取り扱いたい場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

hoge <- readFastq(in_f)                                          #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge                                                             #hogeオブジェクトの中身を表示させてるだけ("ShortReadQ"というクラスのオブジェクトであることがわかる)
showClass("ShortReadQ")                                          #ShortReadQ"というクラスのオブジェクトからどのように情報を取得するかを調べたい場合
reads <- sread(hoge)                                             #塩基配列情報を取り出してreadsに格納
qualities <- quality(hoge)                                       #quality情報を取り出してqualitiesに格納
ids <- id(hoge)                                                  #id情報を取り出してidsに格納

------    ここまで    ------

3. readFastq関数を用いて読み込み、description行の" "以降の文字を削除して、またFASTQ形式で保存したい場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_2.fastq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
#id(reads) <- BStringSet(serial)                                 #id(reads)中の文字列を「serialをBStringSetオブジェクト化したもの」で置き換えることはできないようだ...なのでとりあえず以下のようにしている
out <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "test1.fasta"                                            #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルの読み込み

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#description部分と配列長をファイルに保存
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
width(reads)                                                     #配列長情報を表示
tmp <- cbind(names(reads), width(reads))
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#description部分と配列長＋アルファをファイルに保存
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定
width(reads)                                                     #配列長情報を表示
tmp <- cbind("source", paste("1..", width(reads), sep=""), "note", paste("contig: ", names(reads), sep=""), "", paste("Bombyx mori DNA, W chromosome, contig: ", names(reads), sep=""))
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_1_.*_seq.txt"                                       #"s_1_*_seq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[[1]],1), "\t")                          #filesで読み込んだファイルのリストについて、最初のファイルの一行目をタブで区切って表示させているだけ。5列目のデータが塩基配列情報だということを確認しているにすぎない。
colClasses <- c(rep(list(NULL), 4), "DNAString")                 #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。最初の4列には"NULL"を、最後の5列目には"DNAString"というベクトルを作成してcolClassesに格納している
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納

------    ここまで    ------

1. qseqファイルの読み込みのところまでの場合：
以下はreadの塩基配列とqualityスコア部分の抽出のみの基本形です。
------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                    #"s_*_*_*_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[1], 1), "\t")                           #全部で11列あり、9列目が塩基配列情報、10列目がquality情報だということを確認しているだけ
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[9:10] <- c("DNAString", "BString")                    #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。9, 10列目がそれぞれ"DNAString", "BString"だという情報を与えている
hoge <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をhogeに格納

------    ここまで    ------

2. Illumina FASTQ形式ファイルとして保存したい場合(descriptionのところが通常のqseq2fastq.plの出力結果とほぼ同等の形式にしたい場合)：
つまり、descriptionのところをqseq形式ファイルの「3列目（レーン番号）」：「4列目」：「5列目」：「6列目」：「11列目（pass filterフラグ情報）」で表す場合です。
------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                    #"s_*_*_****_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
out_f <- "hoge_illumina.fq"                                      #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[1], 1), "\t")                           #全部で11列あり、9列目が塩基配列情報、10列目がquality情報だということを確認しているだけ
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[c(3:6,9:11)] <- c("BString","BString","BString","BString","DNAString", "BString", "BString")#DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。例えば9列目が"DNAString"だという情報を与えている
hoge <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をhogeに格納
sequence <- hoge[[5]]                                            #readの塩基配列情報部分をsequenceに格納
sequence <- chartr("-", "N", sequence)                           #"-"になっているものを"N"に置換
quality_s <- hoge[[6]]                                           #readのquality情報部分をquality_sに格納

#FASTQ形式のdescription部分を作成
description <- paste(hoge[[1]], hoge[[2]], hoge[[3]], hoge[[4]], hoge[[7]], sep=":")#FASTQ形式のdescription部分を作成している
out <- ShortReadQ(sequence, quality_s, BStringSet(description)) #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

3. Illumina FASTQ形式ファイルとして保存したい場合(descriptionのところが通常のqseq2fastq.plの出力結果とほぼ同等の形式にしたい場合)：
つまり、descriptionのところをqseq形式ファイルの「3列目（レーン番号）」：「4列目」：「5列目」：「6列目」：「11列目（pass filteringフラグ情報）」で表す場合です。
2と異なる点は、paired-endのファイルをアセンブルするときにはdescriptionのところに"/1"とか"/2"という追加の記述をしておく必要がある場合（例では"/2"を追加したい場合）に以下のやり方を用います。
------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                    #"s_*_*_****_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "/2"                                                   #"/2"という記述をdescription行に追加したい場合
out_f <- "hoge_illumina2.fq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[1], 1), "\t")                           #全部で11列あり、9列目が塩基配列情報、10列目がquality情報だということを確認しているだけ
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[c(3:6,9:11)] <- c("BString","BString","BString","BString","DNAString", "BString", "BString")#DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。例えば9列目が"DNAString"だという情報を与えている
hoge <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をhogeに格納
sequence <- hoge[[5]]                                            #readの塩基配列情報部分をsequenceに格納
sequence <- chartr("-", "N", sequence)                           #"-"になっているものを"N"に置換
quality_s <- hoge[[6]]                                           #readのquality情報部分をquality_sに格納

#FASTQ形式のdescription部分を作成
description <- paste(hoge[[1]], hoge[[2]], hoge[[3]], hoge[[4]], hoge[[7]], sep=":")#FASTQ形式のdescription部分を作成している
description <- paste(description, param2, sep="")                #param2で指定した記述内容の追加
out <- ShortReadQ(sequence, quality_s, BStringSet(description))  #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

4. Sanger FASTQ形式ファイルとして保存したい場合：
------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                    #"s_*_*_****_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "/2"                                                   #"/2"という記述をdescription行に追加したい場合
out_f <- "hoge_sanger2.fq"                                       #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[1], 1), "\t")                           #全部で11列あり、9列目が塩基配列情報、10列目がquality情報だということを確認しているだけ
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[c(3:6,9:11)] <- c("BString","BString","BString","BString","DNAString", "BString", "BString")#DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。例えば9列目が"DNAString"だという情報を与えている
hoge <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をhogeに格納
sequence <- hoge[[5]]                                            #readの塩基配列情報部分をsequenceに格納
sequence <- chartr("-", "N", sequence)                           #"-"になっているものを"N"に置換
quality_s <- hoge[[6]]                                           #readのquality情報部分をquality_sに格納

#FASTQ形式のdescription部分を作成
description <- paste(hoge[[1]], hoge[[2]], hoge[[3]], hoge[[4]], hoge[[7]], sep=":")#FASTQ形式のdescription部分を作成している
description <- paste(description, param2, sep="")                #param2で指定した記述内容の追加

#Illumina qualityスコアをSanger qualityスコアに変換
quality_s <- chartr("@", "!", quality_s)                         #「Illumina ASCII 64」 = 「Sanger ASCII 33」 Phred score = 0に相当
quality_s <- chartr("A", "\"", quality_s)                        #「Illumina ASCII 65」 = 「Sanger ASCII 34」 Phred score = 1に相当
quality_s <- chartr("B", "#", quality_s)                         #「Illumina ASCII 66」 = 「Sanger ASCII 35」 Phred score = 2に相当
quality_s <- chartr("C", "$", quality_s)                         #「Illumina ASCII 67」 = 「Sanger ASCII 36」 Phred score = 3に相当
quality_s <- chartr("D", "%", quality_s)                         #「Illumina ASCII 68」 = 「Sanger ASCII 37」 Phred score = 4に相当
quality_s <- chartr("E", "&", quality_s)                         #「Illumina ASCII 69」 = 「Sanger ASCII 38」 Phred score = 5に相当
quality_s <- chartr("F", "'", quality_s)                         #「Illumina ASCII 70」 = 「Sanger ASCII 39」 Phred score = 6に相当
quality_s <- chartr("G", "(", quality_s)                         #「Illumina ASCII 71」 = 「Sanger ASCII 40」 Phred score = 7に相当
quality_s <- chartr("H", ")", quality_s)                         #「Illumina ASCII 72」 = 「Sanger ASCII 41」 Phred score = 8に相当
quality_s <- chartr("I", "*", quality_s)                         #「Illumina ASCII 73」 = 「Sanger ASCII 42」 Phred score = 9に相当
quality_s <- chartr("J", "+", quality_s)                         #「Illumina ASCII 74」 = 「Sanger ASCII 43」 Phred score =10に相当
quality_s <- chartr("K", ",", quality_s)                         #「Illumina ASCII 75」 = 「Sanger ASCII 44」 Phred score =11に相当
quality_s <- chartr("L", "-", quality_s)                         #「Illumina ASCII 76」 = 「Sanger ASCII 45」 Phred score =12に相当
quality_s <- chartr("M", ".", quality_s)                         #「Illumina ASCII 77」 = 「Sanger ASCII 46」 Phred score =13に相当
quality_s <- chartr("N", "/", quality_s)                         #「Illumina ASCII 78」 = 「Sanger ASCII 47」 Phred score =13に相当
quality_s <- chartr("O", "0", quality_s)                         #「Illumina ASCII 79」 = 「Sanger ASCII 48」 Phred score =14に相当
quality_s <- chartr("P", "1", quality_s)                         #「Illumina ASCII 80」 = 「Sanger ASCII 49」 Phred score =15に相当
quality_s <- chartr("Q", "2", quality_s)                         #「Illumina ASCII 81」 = 「Sanger ASCII 50」 Phred score =16に相当
quality_s <- chartr("R", "3", quality_s)                         #「Illumina ASCII 82」 = 「Sanger ASCII 51」 Phred score =17に相当
quality_s <- chartr("S", "4", quality_s)                         #「Illumina ASCII 83」 = 「Sanger ASCII 52」 Phred score =18に相当
quality_s <- chartr("T", "5", quality_s)                         #「Illumina ASCII 84」 = 「Sanger ASCII 53」 Phred score =19に相当
quality_s <- chartr("U", "6", quality_s)                         #「Illumina ASCII 85」 = 「Sanger ASCII 54」 Phred score =20に相当
quality_s <- chartr("V", "7", quality_s)                         #「Illumina ASCII 86」 = 「Sanger ASCII 55」 Phred score =21に相当
quality_s <- chartr("W", "8", quality_s)                         #「Illumina ASCII 87」 = 「Sanger ASCII 56」 Phred score =22に相当
quality_s <- chartr("X", "9", quality_s)                         #「Illumina ASCII 88」 = 「Sanger ASCII 57」 Phred score =23に相当
quality_s <- chartr("Y", ":", quality_s)                         #「Illumina ASCII 89」 = 「Sanger ASCII 58」 Phred score =24に相当
quality_s <- chartr("Z", ";", quality_s)                         #「Illumina ASCII 90」 = 「Sanger ASCII 59」 Phred score =25に相当
quality_s <- chartr("[", "<", quality_s)                         #「Illumina ASCII 91」 = 「Sanger ASCII 60」 Phred score =26に相当
quality_s <- chartr("\\", "=", quality_s)                        #「Illumina ASCII 92」 = 「Sanger ASCII 61」 Phred score =27に相当
quality_s <- chartr("]", ">", quality_s)                         #「Illumina ASCII 93」 = 「Sanger ASCII 62」 Phred score =28に相当
quality_s <- chartr("^", "?", quality_s)                         #「Illumina ASCII 94」 = 「Sanger ASCII 63」 Phred score =29に相当
quality_s <- chartr("_", "@", quality_s)                         #「Illumina ASCII 95」 = 「Sanger ASCII 64」 Phred score =30に相当
quality_s <- chartr("`", "A", quality_s)                         #「Illumina ASCII 96」 = 「Sanger ASCII 65」 Phred score =31に相当
quality_s <- chartr("a", "B", quality_s)                         #「Illumina ASCII 97」 = 「Sanger ASCII 66」 Phred score =32に相当
quality_s <- chartr("b", "C", quality_s)                         #「Illumina ASCII 98」 = 「Sanger ASCII 67」 Phred score =33に相当
quality_s <- chartr("c", "D", quality_s)                         #「Illumina ASCII 99」 = 「Sanger ASCII 68」 Phred score =34に相当
quality_s <- chartr("d", "E", quality_s)                         #「Illumina ASCII 100」= 「Sanger ASCII 69」 Phred score =35に相当
quality_s <- chartr("e", "F", quality_s)                         #「Illumina ASCII 101」= 「Sanger ASCII 70」 Phred score =36に相当
quality_s <- chartr("f", "G", quality_s)                         #「Illumina ASCII 102」= 「Sanger ASCII 71」 Phred score =37に相当
quality_s <- chartr("g", "H", quality_s)                         #「Illumina ASCII 103」= 「Sanger ASCII 72」 Phred score =38に相当
quality_s <- chartr("h", "I", quality_s)                         #「Illumina ASCII 104」= 「Sanger ASCII 73」 Phred score =39に相当
quality_s <- chartr("i", "J", quality_s)                         #「Illumina ASCII 105」= 「Sanger ASCII 74」 Phred score =40に相当
quality_s <- chartr("j", "K", quality_s)                         #「Illumina ASCII 106」= 「Sanger ASCII 75」 Phred score =41に相当
quality_s <- chartr("k", "L", quality_s)                         #「Illumina ASCII 107」= 「Sanger ASCII 76」 Phred score =42に相当
quality_s <- chartr("l", "M", quality_s)                         #「Illumina ASCII 108」= 「Sanger ASCII 77」 Phred score =43に相当
quality_s <- chartr("m", "N", quality_s)                         #「Illumina ASCII 109」= 「Sanger ASCII 78」 Phred score =44に相当
quality_s <- chartr("n", "O", quality_s)                         #「Illumina ASCII 110」= 「Sanger ASCII 79」 Phred score =45に相当
quality_s <- chartr("o", "P", quality_s)                         #「Illumina ASCII 111」= 「Sanger ASCII 80」 Phred score =46に相当
quality_s <- chartr("p", "Q", quality_s)                         #「Illumina ASCII 112」= 「Sanger ASCII 81」 Phred score =47に相当
quality_s <- chartr("q", "R", quality_s)                         #「Illumina ASCII 113」= 「Sanger ASCII 82」 Phred score =48に相当
quality_s <- chartr("r", "S", quality_s)                         #「Illumina ASCII 114」= 「Sanger ASCII 83」 Phred score =49に相当
quality_s <- chartr("s", "T", quality_s)                         #「Illumina ASCII 115」= 「Sanger ASCII 84」 Phred score =50に相当
quality_s <- chartr("t", "U", quality_s)                         #「Illumina ASCII 116」= 「Sanger ASCII 85」 Phred score =51に相当
quality_s <- chartr("u", "V", quality_s)                         #「Illumina ASCII 117」= 「Sanger ASCII 86」 Phred score =52に相当
quality_s <- chartr("v", "W", quality_s)                         #「Illumina ASCII 118」= 「Sanger ASCII 87」 Phred score =53に相当
quality_s <- chartr("w", "X", quality_s)                         #「Illumina ASCII 119」= 「Sanger ASCII 88」 Phred score =54に相当
quality_s <- chartr("x", "Y", quality_s)                         #「Illumina ASCII 120」= 「Sanger ASCII 89」 Phred score =55に相当
quality_s <- chartr("y", "Z", quality_s)                         #「Illumina ASCII 121」= 「Sanger ASCII 90」 Phred score =56に相当
quality_s <- chartr("z", "[", quality_s)                         #「Illumina ASCII 122」= 「Sanger ASCII 91」 Phred score =57に相当
quality_s <- chartr("{", "\\", quality_s)                        #「Illumina ASCII 123」= 「Sanger ASCII 92」 Phred score =58に相当
quality_s <- chartr("|", "]", quality_s)                         #「Illumina ASCII 124」= 「Sanger ASCII 93」 Phred score =59に相当
quality_s <- chartr("}", "^", quality_s)                         #「Illumina ASCII 125」= 「Sanger ASCII 94」 Phred score =60に相当
quality_s <- chartr("~", "_", quality_s)                         #「Illumina ASCII 126」= 「Sanger ASCII 95」 Phred score =61に相当

out <- ShortReadQ(sequence, quality_s, BStringSet(description))  #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

5. Sanger FASTQ形式ファイルとして保存したい場合：
4.のやり方に加えて、*.qseq.txtファイルの最後の列にあるpass filteringフラグが1のもののみ抽出したい場合です。
このpass filteringはIllumina独自のquality情報で、「0のものはqualityが低く、1のものはqualityが高い」という0 or 1で表現されています。
注意点としては、paired-endの場合は、独立の二つのファイルとして得られることになりますが、両方で1という基準にする必要があります。
そのため、4で得た二つのpaired-endファイルを入力ファイルとして読み込んで両方で1というfiteringをやらないといけません。
------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                    #"s_*_*_****_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "/2"                                                   #"/2"という記述をdescription行に追加したい場合
out_f <- "hoge_sanger2.fq"                                       #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[1], 1), "\t")                           #全部で11列あり、9列目が塩基配列情報、10列目がquality情報だということを確認しているだけ
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[c(3:6,9:11)] <- c("BString","BString","BString","BString","DNAString", "BString", "BString")#DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。例えば9列目が"DNAString"だという情報を与えている
hoge <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をhogeに格納
sequence <- hoge[[5]]                                            #readの塩基配列情報部分をsequenceに格納
sequence <- chartr("-", "N", sequence)                           #"-"になっているものを"N"に置換
quality_s <- hoge[[6]]                                           #readのquality情報部分をquality_sに格納
pass_filter <- hoge[[7]]                                         #pass filtering情報部分をpass_filterに格納

#FASTQ形式のdescription部分を作成
description <- paste(hoge[[1]], hoge[[2]], hoge[[3]], hoge[[4]], hoge[[7]], sep=":")#FASTQ形式のdescription部分を作成している
description <- paste(description, param2, sep="")                #param2で指定した記述内容の追加

#Illumina qualityスコアをSanger qualityスコアに変換
quality_s <- chartr("@", "!", quality_s)                         #「Illumina ASCII 64」 = 「Sanger ASCII 33」 Phred score = 0に相当
quality_s <- chartr("A", "\"", quality_s)                        #「Illumina ASCII 65」 = 「Sanger ASCII 34」 Phred score = 1に相当
quality_s <- chartr("B", "#", quality_s)                         #「Illumina ASCII 66」 = 「Sanger ASCII 35」 Phred score = 2に相当
quality_s <- chartr("C", "$", quality_s)                         #「Illumina ASCII 67」 = 「Sanger ASCII 36」 Phred score = 3に相当
quality_s <- chartr("D", "%", quality_s)                         #「Illumina ASCII 68」 = 「Sanger ASCII 37」 Phred score = 4に相当
quality_s <- chartr("E", "&", quality_s)                         #「Illumina ASCII 69」 = 「Sanger ASCII 38」 Phred score = 5に相当
quality_s <- chartr("F", "'", quality_s)                         #「Illumina ASCII 70」 = 「Sanger ASCII 39」 Phred score = 6に相当
quality_s <- chartr("G", "(", quality_s)                         #「Illumina ASCII 71」 = 「Sanger ASCII 40」 Phred score = 7に相当
quality_s <- chartr("H", ")", quality_s)                         #「Illumina ASCII 72」 = 「Sanger ASCII 41」 Phred score = 8に相当
quality_s <- chartr("I", "*", quality_s)                         #「Illumina ASCII 73」 = 「Sanger ASCII 42」 Phred score = 9に相当
quality_s <- chartr("J", "+", quality_s)                         #「Illumina ASCII 74」 = 「Sanger ASCII 43」 Phred score =10に相当
quality_s <- chartr("K", ",", quality_s)                         #「Illumina ASCII 75」 = 「Sanger ASCII 44」 Phred score =11に相当
quality_s <- chartr("L", "-", quality_s)                         #「Illumina ASCII 76」 = 「Sanger ASCII 45」 Phred score =12に相当
quality_s <- chartr("M", ".", quality_s)                         #「Illumina ASCII 77」 = 「Sanger ASCII 46」 Phred score =13に相当
quality_s <- chartr("N", "/", quality_s)                         #「Illumina ASCII 78」 = 「Sanger ASCII 47」 Phred score =13に相当
quality_s <- chartr("O", "0", quality_s)                         #「Illumina ASCII 79」 = 「Sanger ASCII 48」 Phred score =14に相当
quality_s <- chartr("P", "1", quality_s)                         #「Illumina ASCII 80」 = 「Sanger ASCII 49」 Phred score =15に相当
quality_s <- chartr("Q", "2", quality_s)                         #「Illumina ASCII 81」 = 「Sanger ASCII 50」 Phred score =16に相当
quality_s <- chartr("R", "3", quality_s)                         #「Illumina ASCII 82」 = 「Sanger ASCII 51」 Phred score =17に相当
quality_s <- chartr("S", "4", quality_s)                         #「Illumina ASCII 83」 = 「Sanger ASCII 52」 Phred score =18に相当
quality_s <- chartr("T", "5", quality_s)                         #「Illumina ASCII 84」 = 「Sanger ASCII 53」 Phred score =19に相当
quality_s <- chartr("U", "6", quality_s)                         #「Illumina ASCII 85」 = 「Sanger ASCII 54」 Phred score =20に相当
quality_s <- chartr("V", "7", quality_s)                         #「Illumina ASCII 86」 = 「Sanger ASCII 55」 Phred score =21に相当
quality_s <- chartr("W", "8", quality_s)                         #「Illumina ASCII 87」 = 「Sanger ASCII 56」 Phred score =22に相当
quality_s <- chartr("X", "9", quality_s)                         #「Illumina ASCII 88」 = 「Sanger ASCII 57」 Phred score =23に相当
quality_s <- chartr("Y", ":", quality_s)                         #「Illumina ASCII 89」 = 「Sanger ASCII 58」 Phred score =24に相当
quality_s <- chartr("Z", ";", quality_s)                         #「Illumina ASCII 90」 = 「Sanger ASCII 59」 Phred score =25に相当
quality_s <- chartr("[", "<", quality_s)                         #「Illumina ASCII 91」 = 「Sanger ASCII 60」 Phred score =26に相当
quality_s <- chartr("\\", "=", quality_s)                        #「Illumina ASCII 92」 = 「Sanger ASCII 61」 Phred score =27に相当
quality_s <- chartr("]", ">", quality_s)                         #「Illumina ASCII 93」 = 「Sanger ASCII 62」 Phred score =28に相当
quality_s <- chartr("^", "?", quality_s)                         #「Illumina ASCII 94」 = 「Sanger ASCII 63」 Phred score =29に相当
quality_s <- chartr("_", "@", quality_s)                         #「Illumina ASCII 95」 = 「Sanger ASCII 64」 Phred score =30に相当
quality_s <- chartr("`", "A", quality_s)                         #「Illumina ASCII 96」 = 「Sanger ASCII 65」 Phred score =31に相当
quality_s <- chartr("a", "B", quality_s)                         #「Illumina ASCII 97」 = 「Sanger ASCII 66」 Phred score =32に相当
quality_s <- chartr("b", "C", quality_s)                         #「Illumina ASCII 98」 = 「Sanger ASCII 67」 Phred score =33に相当
quality_s <- chartr("c", "D", quality_s)                         #「Illumina ASCII 99」 = 「Sanger ASCII 68」 Phred score =34に相当
quality_s <- chartr("d", "E", quality_s)                         #「Illumina ASCII 100」= 「Sanger ASCII 69」 Phred score =35に相当
quality_s <- chartr("e", "F", quality_s)                         #「Illumina ASCII 101」= 「Sanger ASCII 70」 Phred score =36に相当
quality_s <- chartr("f", "G", quality_s)                         #「Illumina ASCII 102」= 「Sanger ASCII 71」 Phred score =37に相当
quality_s <- chartr("g", "H", quality_s)                         #「Illumina ASCII 103」= 「Sanger ASCII 72」 Phred score =38に相当
quality_s <- chartr("h", "I", quality_s)                         #「Illumina ASCII 104」= 「Sanger ASCII 73」 Phred score =39に相当
quality_s <- chartr("i", "J", quality_s)                         #「Illumina ASCII 105」= 「Sanger ASCII 74」 Phred score =40に相当
quality_s <- chartr("j", "K", quality_s)                         #「Illumina ASCII 106」= 「Sanger ASCII 75」 Phred score =41に相当
quality_s <- chartr("k", "L", quality_s)                         #「Illumina ASCII 107」= 「Sanger ASCII 76」 Phred score =42に相当
quality_s <- chartr("l", "M", quality_s)                         #「Illumina ASCII 108」= 「Sanger ASCII 77」 Phred score =43に相当
quality_s <- chartr("m", "N", quality_s)                         #「Illumina ASCII 109」= 「Sanger ASCII 78」 Phred score =44に相当
quality_s <- chartr("n", "O", quality_s)                         #「Illumina ASCII 110」= 「Sanger ASCII 79」 Phred score =45に相当
quality_s <- chartr("o", "P", quality_s)                         #「Illumina ASCII 111」= 「Sanger ASCII 80」 Phred score =46に相当
quality_s <- chartr("p", "Q", quality_s)                         #「Illumina ASCII 112」= 「Sanger ASCII 81」 Phred score =47に相当
quality_s <- chartr("q", "R", quality_s)                         #「Illumina ASCII 113」= 「Sanger ASCII 82」 Phred score =48に相当
quality_s <- chartr("r", "S", quality_s)                         #「Illumina ASCII 114」= 「Sanger ASCII 83」 Phred score =49に相当
quality_s <- chartr("s", "T", quality_s)                         #「Illumina ASCII 115」= 「Sanger ASCII 84」 Phred score =50に相当
quality_s <- chartr("t", "U", quality_s)                         #「Illumina ASCII 116」= 「Sanger ASCII 85」 Phred score =51に相当
quality_s <- chartr("u", "V", quality_s)                         #「Illumina ASCII 117」= 「Sanger ASCII 86」 Phred score =52に相当
quality_s <- chartr("v", "W", quality_s)                         #「Illumina ASCII 118」= 「Sanger ASCII 87」 Phred score =53に相当
quality_s <- chartr("w", "X", quality_s)                         #「Illumina ASCII 119」= 「Sanger ASCII 88」 Phred score =54に相当
quality_s <- chartr("x", "Y", quality_s)                         #「Illumina ASCII 120」= 「Sanger ASCII 89」 Phred score =55に相当
quality_s <- chartr("y", "Z", quality_s)                         #「Illumina ASCII 121」= 「Sanger ASCII 90」 Phred score =56に相当
quality_s <- chartr("z", "[", quality_s)                         #「Illumina ASCII 122」= 「Sanger ASCII 91」 Phred score =57に相当
quality_s <- chartr("{", "\\", quality_s)                        #「Illumina ASCII 123」= 「Sanger ASCII 92」 Phred score =58に相当
quality_s <- chartr("|", "]", quality_s)                         #「Illumina ASCII 124」= 「Sanger ASCII 93」 Phred score =59に相当
quality_s <- chartr("}", "^", quality_s)                         #「Illumina ASCII 125」= 「Sanger ASCII 94」 Phred score =60に相当
quality_s <- chartr("~", "_", quality_s)                         #「Illumina ASCII 126」= 「Sanger ASCII 95」 Phred score =61に相当

out <- ShortReadQ(sequence, quality_s, BStringSet(description))  #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
out <- out[as.character(pass_filter) == "1"]                     #pass_filter中の値が1のもののみ抽出
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

1. ディレクトリの変更をちゃんとやった場合：
------    ここから    ------
in_f <- "wt_1_f.bowtie.gz"                                       #読み込みたいBowtie形式出力ファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

output <- readAligned(in_f, type="Bowtie")                       #in_fで指定したファイルの読み込み
output                                                           #読み込んだAlignedReadオブジェクトoutputを表示

------    ここまで    ------

2. 任意のディレクトリ位置から、以下のようにして特定の場所にある目的のファイルを読み込むことも可能です：
「コンピュータ - OS(C:) - Program Files - R - R-2.15.2 - library - yeastRNASeq - reads」
------    ここから    ------
in_f <- "wt_1_f.bowtie.gz"                                       #読み込みたいBowtie形式出力ファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#yeastRNASeqパッケージ中のreadsフォルダ中に目的のファイルがあることがわかっているので...
path <- file.path(system.file(package = "yeastRNASeq", "reads"))
output <- readAligned(path, in_f, type="Bowtie")                 #in_fで指定したファイルの読み込み
output                                                           #読み込んだAlignedReadオブジェクトoutputを表示

------    ここまで    ------

------    ここから    ------

#必要なパッケージなどをロード
library(Rsamtools)                                               #パッケージの読み込み

------    ここまで    ------

------    ここから    ------

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(qrqc)                                                    #パッケージの読み込み

reads <- readSeqFile(in_f, quality="phred")                      #FASTQ形式ファイルの読み込み（Sanger FASTQ形式の場合は"phred", Illumina FASTQ形式の場合は"illumina"にすればよい）
makeReport(reads)                                                #htmlレポートの作成

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam1に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fastq")                  #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(reads))[,1:4])   #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
out <- reads[width(reads) == count]                              #各readの長さ（width(reads)）とcountの結果を比較して、同じ長さもののみoutに格納

#ファイルへの出力
names(out) <- paste(param1, 1:length(out), sep="_")              #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam1に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fastq")                  #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(reads))[,1:4])   #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
out <- reads[width(reads) == count]                              #各readの長さ（width(reads)）とcountの結果を比較して、同じ長さもののみoutに格納

out1 <- tables(out, n=length(unique(out)))                       #読まれた頻度順にsequenceをソートして結果をout1に格納
out2 <- DNAStringSet(names(out1$top))                            #sequenceの配列情報（「names(out1$top)」）をDNAStringSetオブジェクトとしてout2に格納
names(out2) <- paste(param1, 1:length(out2), out1$top, sep="_")  #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
writeXStringSet(out2, file=out_f, format="fasta", width=80)      #out2の中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

1. ラットの上流配列(1000bp)ファイル（rat_upstream_1000.fa）からRefSeq IDの部分のみを抽出したい場合：
抽出例：「NM_022953_up_1000_chr1_268445091_r chr1:268445091-268446090」--> 「NM_022953」
戦略："_up_"を区切り文字として分割（"NM_022953"と"1000_chr1_268445091_r chr1:268445091-268446090"）し、分割後の一つ目の要素を抽出
------    ここから    ------
in_f <- "rat_upstream_1000.fa"                                   #multi-fastaファイル名を指定
out_f <- "hoge1.fa"                                              #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルを読み込んでseqに格納

#本番
hoge <- strsplit(names(seq), "_up_", fixed=TRUE)                 #names(reads)中の文字列を"_up_"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 1))                           #hogeのリスト中の1番目の要素(これがRefSeq IDに相当)を抽出してhoge2に格納
names(seq) <- hoge2                                              #names(seq)の中身をhoge2で置換

#ファイルに保存
writeXStringSet(seq, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

2. Trinity.fastaから最初のスペースで区切られる前の文字列のみにしたい場合：
抽出例：「comp59_c0_seq1 len=537 ~FPKM=305.1 path=[0:0-536]」--> 「comp59_c0_seq1」
戦略：" "を区切り文字として分割（"comp59_c0_seq1", "len=537", "~FPKM=305.1", "path=[0:0-536]"）し、分割後の一つ目の要素を抽出
------    ここから    ------
in_f <- "Trinity.fasta"                                          #multi-fastaファイル名を指定
out_f <- "hoge2.fa"                                              #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルを読み込んでseqに格納

#本番
hoge <- strsplit(names(seq), " ", fixed=TRUE)                    #names(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 1))                           #hogeのリスト中の1番目の要素(これがRefSeq IDに相当)を抽出してhoge2に格納
names(seq) <- hoge2                                              #names(seq)の中身をhoge2で置換

#ファイルに保存
writeXStringSet(seq, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

3. DHFR.fastaからRefSeq ID部分のみ抽出したい場合：
抽出例：「gi|68303806|ref|NM_000791.3| Homo sapiens dihydrofolate reductase (DHFR), mRNA」--> 「NM_000791.3」
戦略："|"を区切り文字として分割（"gi", "68303806", "ref", "NM_000791.3", " Homo sapiens dihydrofolate reductase (DHFR), mRNA"）し、分割後の4番目の要素を抽出
------    ここから    ------
in_f <- "DHFR.fasta"                                             #multi-fastaファイル名を指定
out_f <- "hoge3.fa"                                              #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルを読み込んでseqに格納

#本番
hoge <- strsplit(names(seq), "|", fixed=TRUE)                    #names(reads)中の文字列を"|"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 4))                           #hogeのリスト中の4番目の要素(これがRefSeq IDに相当)を抽出してhoge2に格納
names(seq) <- hoge2                                              #names(seq)の中身をhoge2で置換

#ファイルに保存
writeXStringSet(seq, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

4. DHFR.fastaからバージョン番号を除いたRefSeq ID部分のみ抽出したい場合：
抽出例：「gi|68303806|ref|NM_000791.3| Homo sapiens dihydrofolate reductase (DHFR), mRNA」--> 「NM_000791」
戦略："|"を区切り文字として分割（"gi", "68303806", "ref", "NM_000791.3", " Homo sapiens dihydrofolate reductase (DHFR), mRNA"）し、分割後の4番目の要素を抽出。
戦略：さらに今度は"."を区切り文字として分割（"NM_000791", "3"）し、分割後の1番目の要素を抽出。
------    ここから    ------
in_f <- "DHFR.fasta"                                             #multi-fastaファイル名を指定
out_f <- "hoge4.fa"                                              #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルを読み込んでseqに格納

#本番
hoge <- strsplit(names(seq), "|", fixed=TRUE)                    #names(reads)中の文字列を"|"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 4))                           #hogeのリスト中の4番目の要素(これがRefSeq IDに相当)を抽出してhoge2に格納
hoge3 <- strsplit(hoge2, ".", fixed=TRUE)                        #hoge2中の文字列を"."で区切った結果をリスト形式でhoge3に格納
hoge4 <- unlist(lapply(hoge3, "[[", 1))                          #hoge3のリスト中の1番目の要素(これがRefSeq IDのバージョン部分以外に相当)を抽出してhoge4に格納
names(seq) <- hoge4                                              #names(seq)の中身をhoge4で置換

#ファイルに保存
writeXStringSet(seq, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "rat_upstream_1000.fa"                                   #multi-fastaファイル名を指定
out_f <- "hoge1.fa"                                              #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定
param <- 0                                                       #許容するACGT以外の文字数を指定(0の場合はACGTのみからなる配列のみ抽出することに相当。5の場合はACGT以外の文字が含まれるのを5個まで許容することに相当)

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルを読み込んでseqに格納

#ACGT以外の文字数をカウントしてフィルタリングするところ
count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(seq))[,1:4])     #各塩基配列についてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
obj <- (width(seq) - count) <= param                             #各塩基配列についてACGT以外の文字数が(param)個以下の場合にTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルobjを作成
out <- seq[obj]                                                  #seqという配列集合からobjがTRUEとなる要素のみ抽出してoutに格納

#ファイルに保存
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

1. hoge4.faファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge1.fasta"                                           #出力ファイル名を指定
param <- 50                                                      #配列長の閾値を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
reads <- reads[width(reads) >= param]                            #paramで指定した配列長以上のもののみ抽出してreadsに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta")               #out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

2. h_rna.fastaファイルの場合:
------    ここから    ------
in_f <- "h_rna.fasta"                                            #multi-fasta形式のファイルを指定
out_f <- "hoge2.fasta"                                           #出力ファイル名を指定
param <- 200                                                     #配列長の閾値を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
reads <- reads[width(reads) >= param]                            #paramで指定した配列長以上のもののみ抽出してreadsに格納
reads                                                            #今現在のreadsオブジェクトを表示
writeXStringSet(reads, file=out_f, format="fasta")               #out_fで指定したファイル名でreadsというオブジェクトをfasta形式で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f1 <- "rat_upstream_1000.fa"                                  #multi-fastaファイル名を指定
in_f2 <- "result_rankprod_BAT_RefSeq_DEG.txt"                    #IDリストファイル名を指定
out_f <- "seq_BAT_DEG.fa"                                        #出力ファイル名（IDリストに一致する配列）を指定
param <- 0                                                       #許容するACGT以外の文字数を指定(0の場合はACGTのみからなる配列のみ抽出することに相当。5の場合はACGT以外の文字が含まれるのを5個まで許容することに相当)

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                   #in_f1で指定したファイルを読み込んでseqに格納
keywords <- readLines(in_f2)                                     #in_f2で指定したファイルを読み込んでkeywordsに格納

#(in_f2で読み込んだRefSeq ID情報からなるkeywordsベクトルと対応がとれるように)seq中のdescription部分を改変
hoge <- strsplit(names(seq), "_up_", fixed=TRUE)                 #names(reads)中の文字列を"_up_"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 1))                           #hogeのリスト中の1番目の要素(これがRefSeq IDに相当)を抽出してhoge2に格納
names(seq) <- hoge2                                              #names(seq)の中身をhoge2で置換

seq <- unique(seq)                                               #重複を除去（13452 sequences --> 12998 sequences）
seq <- seq[width(seq) == median(width(seq))]                     #この場合上流1000bpの配列集合を取り扱っているはずだが、まれにそうでないものが含まれるので配列集合の配列長の中央値と同じでないものを排除している（12998 sequences --> 12997 sequences）

count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(seq))[,1:4])     #各塩基配列についてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
obj <- (width(seq) - count) <= param                             #各塩基配列についてACGT以外の文字数が(param)個以下の場合にTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルobjを作成
seq <- seq[obj]                                                  #seqという配列集合からobjがTRUEとなる要素のみ抽出（12997 sequences --> 12261 sequences）してoutに格納

#本番（names(seq)中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるものを抽出して保存。複数のRefSeq IDになっているものは無視の方向で...。）
out <- seq[is.element(names(seq), keywords)]                     #names(seq)中の各要素がベクトルkeywords中に含まれるものをoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60にして、out_fで指定したファイル名でfasta形式で保存

------    ここまで    ------

1. アダプター配列が8塩基の場合：
------    ここから    ------
param1 <- DNAStringSet(c("GCTTTCCCCAAGTAGGT","TTCTGCTTGGATCGGAAG"))#アダプター配列を含む塩基配列を指定してparam1に格納
param2 <- "ACGTACGT"                                             #アダプター配列情報を指定してparam2に格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#左側にアダプター配列が含まれている場合1（100%マッチ）：
trimLRPatterns(Lpattern=param2, subject=param1, max.Lmismatch=0) #max.Lmismatch=0はミスマッチが0個という意味。2番目の配列の左端のTがアダプター配列と認識されてトリミングされている

#左側にアダプター配列が含まれている場合2（100%マッチ）：
trimLRPatterns(Lpattern=param2, subject=param1, max.Lmismatch=rep(0, nchar(param2)))#max.Lmismatch=0はミスマッチが0個という意味。2番目の配列の左端のTがアダプター配列と認識されてトリミングされている

#右側にアダプター配列が含まれている場合1（100%マッチ）：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=0) #max.Rmismatch=0はミスマッチが0個という意味。100%マッチのところはないのでparam1の配列がそのまま表示されている

#右側にアダプター配列が含まれている場合2（100%マッチ）：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=rep(0, nchar(param2)))#max.Rmismatch=0はミスマッチが0個という意味。100%マッチのところはないのでparam1の配列がそのまま表示されている

#右側にアダプター配列が含まれている場合1（ミスマッチを2個まで許容）：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=2) #param1の1番目の配列の右側8塩基はちゃんとトリミングされているが、2番目の配列の右側3塩基はされてないのはなぜ？

#右側にアダプター配列が含まれている場合2（ミスマッチを2個まで許容）：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=rep(2, nchar(param2)))#param1の1番目の配列の右側8塩基、2番目の配列の右側3塩基がトリミングされている

------    ここまで    ------

2. RNA配列の右側をちょっと変えた場合：
------    ここから    ------
param1 <- DNAStringSet(c("GCTTTCCCCAAGTAGAC","TTCTGCTTGGATCGGATG"))#アダプター配列を含む塩基配列を指定してparam1に格納
param2 <- "ACGTACGT"                                             #アダプター配列情報を指定してparam2に格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#ミスマッチを2個まで許容：
#rep(2, nchar(param2))の意味は以下のとおりです。
#param2の最初の1塩基分(A)を2塩基ミスマッチで探索
#param2の最初の2塩基分(AC)を2塩基ミスマッチで探索
#param2の最初の3塩基分(ACG)を2塩基ミスマッチで探索
#...
#param2の最初のnchar(param2)塩基分(ACGTACGT)を2塩基ミスマッチで探索
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=rep(2, nchar(param2)))#2塩基ミスマッチを許容とはいっても”常識的な”トリミングをしてくれるのね

#ミスマッチを2個まで許容（失敗例）：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=2) #なんで違った結果になるんでしょうね？！

------    ここまで    ------

3. 右側のアダプター配列が8塩基のままで許容ミスマッチを個数ではなく割合で指定する場合：
------    ここから    ------
param1 <- DNAStringSet(c("GCTTTCCCCAAGTAGGT","GCTTTCCCCACGTAGGT","GCTTTCCCCTCGTAGGT"))#アダプター配列を含む塩基配列を指定してparam1に格納
param2 <- "ACGTACGT"                                             #アダプター配列情報を指定してparam2に格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#ミスマッチの割合を0.3(アダプター30%)まで許容：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=0.3)#

#ミスマッチの割合を0.2(アダプター20%)まで許容：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=0.2)#

#ミスマッチの割合を0.1(アダプター10%)まで許容：
trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=0.1)#

------    ここまで    ------

4. アダプター除去後の配列がx塩基以上含むものという指定をしたい場合：
------    ここから    ------
param1 <- DNAStringSet(c("GCTTTCCCCAAGTAGGT","GCTTTCCCCAAGTACGT","GCTTTCCCCAAGTAGAC"))#アダプター配列を含む塩基配列を指定してparam1に格納
param2 <- "ACGTACGT"                                             #アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 15                                                     #xの値を指定してparam3に格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#100%マッチ：
hoge <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=rep(0, nchar(param2))) #max.Rmismatch=0はミスマッチが0個という意味。100%マッチのところはないのでparam1の配列がそのまま表示されている
out <- hoge[hoge@ranges@width >= param3,]                        #条件を満たすものだけを抽出してoutに格納
out                                                              #outの中身を表示

#ミスマッチを2個まで許容：
hoge <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=param1, max.Rmismatch=rep(2, nchar(param2)))#param1の1番目の配列の右側8塩基が、2番目の配列の右側3塩基（なぜ4塩基じゃない？！）がトリミングされている
out <- hoge[hoge@ranges@width >= param3,]                        #条件を満たすものだけを抽出してoutに格納
out                                                              #outの中身を表示

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_1_.*_seq.txt"                                       #"s_1_*_seq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 0                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam3に格納
param4 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam4に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
strsplit(readLines(files[[1]],1), "\t")                          #filesで読み込んだファイルのリストについて、最初のファイルの一行目をタブで区切って表示させているだけ。5列目のデータが塩基配列情報だということを確認しているにすぎない。
colClasses <- c(rep(list(NULL), 4), "DNAString")                 #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。最初の4列には"NULL"を、最後の5列目には"DNAString"というベクトルを作成してcolClassesに格納している
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納
out <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=reads[[1]], max.Rmismatch = rep(param3, nchar(param2)))
names(out) <- paste(param4, 1:length(out), sep="_")              #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)       #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存（Xeon W5590 3.33GHz 98GBメモリマシンでも30秒程度かかります...）。

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#同一配列（idensical reads）何回も読まれている場合があるので、
#out中の配列群について、一回しか出現していないreadが何個あったかという情報を得たい場合：
tables(out)$distribution                                         #k回出現したreadがn個あったという情報を表形式で出力（1回しか出現しなかったのが2125 reads、2回出現したのが19 reads、...）

#out中の配列群について、配列長の最小と最大の情報を得たい場合1：
range(out@ranges@width)                                          #配列長のベクトル（out@ranges@width）に対してrange関数を適用

#out中の配列群について、配列長の最小と最大の情報を得たい場合2：
c(min(out@ranges@width), max(out@ranges@width))                  #配列長のベクトル（out@ranges@width）に対してmin関数とmax関数を適用

#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてR Console上に表示したい場合：
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
out2

#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてファイルに出力したい場合：
out_f2 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
write.table(out2, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#out2の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_1_.*_seq.txt"                                       #"s_1_*_seq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam3に格納
param4 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam4に格納
param5 <- 23:30                                                  #RNA配列長の範囲を指定してparam5に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
colClasses <- c(rep(list(NULL), 4), "DNAString")                 #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。最初の4列には"NULL"を、最後の5列目には"DNAString"というベクトルを作成してcolClassesに格納している
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納
hoge <- reads[[1]]@ranges@width                                  #以下のプログラムを見やすくするためにアダプター配列除去前のベクトル（reads[[1]]@ranges@width）をhogeに格納
if(length(hoge) != sum(hoge == mean(hoge))){                     #以下の4行分のif文で、hogeの各要素についてhogeの平均値（この場合mean(hoge)=36に相当）
    cat("Error: Lengths of reads with adapter are different!\n") #に等しいものをカウントした結果（右辺に相当；この場合2220）が、元々のhogeの要素数
    cat("You cannot use this program!\n")                        #（左辺のlength(hoge)に相当；この場合も2220）と等しくなければError以下の文を表示させている。
}else{                                                           #もしこの文が表示されたら、同じ配列長でないものが含まれていることを意味するので、RNA配列長を指定することはあきらめてください
    hoge2 <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=reads[[1]], max.Rmismatch = rep(param3, nchar(param2)))#アダプターを含む配列の長さが全部同じだった場合のみ、アダプター配列除去を行い、結果をhoge2に格納
    out <- hoge2[((hoge2@ranges@width >= min(param5)) & (hoge2@ranges@width <= max(param5))),]#hoge2の中からparam5で指定した配列長の条件を満たすもののみ抽出してoutに格納
    names(out) <- paste(param4, 1:length(out), sep="_")          #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
    writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=80)   #outの中身をout_fで指定したファイル名で保存
}

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてファイルに出力したい場合：
out_f2 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
write.table(out2, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#out2の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_1_.*_seq.txt"                                       #"s_1_*_seq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam3に格納
param4 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam4に格納
param5 <- 23:30                                                  #RNA配列長の範囲を指定してparam5に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
colClasses <- c(rep(list(NULL), 4), "DNAString")                 #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。最初の4列には"NULL"を、最後の5列目には"DNAString"というベクトルを作成してcolClassesに格納している
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納
hoge <- reads[[1]]@ranges@width                                  #以下のプログラムを見やすくするためにアダプター配列除去前のベクトル（reads[[1]]@ranges@width）をhogeに格納
if(length(hoge) != sum(hoge == mean(hoge))){                     #以下の4行分のif文で、hogeの各要素についてhogeの平均値（この場合mean(hoge)=36に相当）
    cat("Error: Lengths of reads with adapter are different!\n") #に等しいものをカウントした結果（右辺に相当；この場合2220）が、元々のhogeの要素数
    cat("You cannot use this program!\n")                        #（左辺のlength(hoge)に相当；この場合も2220）と等しくなければError以下の文を表示させている。
}else{                                                           #もしこの文が表示されたら、同じ配列長でないものが含まれていることを意味するので、RNA配列長を指定することはあきらめてください
    hoge2 <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=reads[[1]], max.Rmismatch = rep(param3, nchar(param2)))#アダプターを含む配列の長さが全部同じだった場合のみ、アダプター配列除去を行い、結果をhoge2に格納
    out <- hoge2[((hoge2@ranges@width >= min(param5)) & (hoge2@ranges@width <= max(param5))),]#hoge2の中からparam5で指定した配列長の条件を満たすもののみ抽出してoutに格納
    count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(out))[,1:4]) #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
    out2 <- out[out@ranges@width == count]                       #各readの長さ（out@ranges@width）とcountの結果を比較して、同じ長さもののみout2に格納
    names(out2) <- paste(param4, 1:length(out2), sep="_")        #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
    writeXStringSet(out2, file=out_f, format="fasta", width=80)  #out2の中身をout_fで指定したファイル名で保存
}

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてファイルに出力したい場合：
out_f2 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
write.table(out2, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#out2の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_1_.*_seq.txt"                                       #"s_1_*_seq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam3に格納
param4 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam4に格納
param5 <- 23:30                                                  #RNA配列長の範囲を指定してparam5に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
colClasses <- c(rep(list(NULL), 4), "DNAString")                 #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。最初の4列には"NULL"を、最後の5列目には"DNAString"というベクトルを作成してcolClassesに格納している
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納
hoge <- reads[[1]]@ranges@width                                  #以下のプログラムを見やすくするためにアダプター配列除去前のベクトル（reads[[1]]@ranges@width）をhogeに格納
if(length(hoge) != sum(hoge == mean(hoge))){                     #以下の4行分のif文で、hogeの各要素についてhogeの平均値（この場合mean(hoge)=36に相当）
    cat("Error: Lengths of reads with adapter are different!\n") #に等しいものをカウントした結果（右辺に相当；この場合2220）が、元々のhogeの要素数
    cat("You cannot use this program!\n")                        #（左辺のlength(hoge)に相当；この場合も2220）と等しくなければError以下の文を表示させている。
}else{                                                           #もしこの文が表示されたら、同じ配列長でないものが含まれていることを意味するので、RNA配列長を指定することはあきらめてください
    hoge2 <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=reads[[1]], max.Rmismatch = rep(param3, nchar(param2)))#アダプターを含む配列の長さが全部同じだった場合のみ、アダプター配列除去を行い、結果をhoge2に格納
    out <- hoge2[((hoge2@ranges@width >= min(param5)) & (hoge2@ranges@width <= max(param5))),]#hoge2の中からparam5で指定した配列長の条件を満たすもののみ抽出してoutに格納
    count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(out))[,1:4]) #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
    out2 <- out[out@ranges@width == count]                       #各readの長さ（out@ranges@width）とcountの結果を比較して、同じ長さもののみout2に格納
    out3 <- tables(out2, n=length(unique(out2)))                 #読まれた頻度順にshord readをソートして結果をout3に格納      
    out4 <- DNAStringSet(names(out3$top))                        #short readsの配列情報（「names(out3$top)」）をDNAStringSetオブジェクトとしてout4に格納
    names(out4) <- paste(param4, 1:length(out4), out3$top, sep="_")#(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
    writeXStringSet(out4, file=out_f, format="fasta", width=80)  #out4の中身をout_fで指定したファイル名で保存
}

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてファイルに出力したい場合：
out_f2 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
write.table(out2, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#out2の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
param1 <- "s_._._.*_qseq.txt"                                       #"s_._._.*_qseq.txt"という感じのファイル名のものを読み込みたい場合("."の有無に注意！！)
param2 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam2に格納
param3 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam3に格納
param4 <- "kkk"                                                  #(multi-)FASTA形式のdescription部分（の一部）を指定してparam4に格納
param5 <- 23:30                                                  #RNA配列長の範囲を指定してparam5に格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

files <- list.files(getwd(), pattern=param1)                     #param1で指定した正規表現にマッチする文字列を含むファイルのリストをfilesに格納
colClasses <- rep(list(NULL), 11)                                #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。初期値として全11列に"NULL"を与えている
colClasses[9:10] <- c("DNAString", "BString")                    #DNAStringSetというオブジェクト形式にするための情報を予め作成している。9, 10列目がそれぞれ"DNAString", "BString"だという情報を与えている
reads <- readXStringColumns(getwd(), param1, colClasses = colClasses)#colClassesで指定した列（この場合5列目）をreadXStringColumns関数を用いて読み込むことでXStringSetオブジェクト（この場合"X"は"DNA"に相当）にした結果をreadsに格納
hoge <- reads[[1]]@ranges@width                                  #以下のプログラムを見やすくするためにアダプター配列除去前のベクトル（reads[[1]]@ranges@width）をhogeに格納
if(length(hoge) != sum(hoge == mean(hoge))){                     #以下の4行分のif文で、hogeの各要素についてhogeの平均値（この場合mean(hoge)=36に相当）
    cat("Error: Lengths of reads with adapter are different!\n") #に等しいものをカウントした結果（右辺に相当；この場合2220）が、元々のhogeの要素数
    cat("You cannot use this program!\n")                        #（左辺のlength(hoge)に相当；この場合も2220）と等しくなければError以下の文を表示させている。
}else{                                                           #もしこの文が表示されたら、同じ配列長でないものが含まれていることを意味するので、RNA配列長を指定することはあきらめてください
    hoge2 <- trimLRPatterns(Rpattern=param2, subject=reads[[1]], max.Rmismatch = rep(param3, nchar(param2)))#アダプターを含む配列の長さが全部同じだった場合のみ、アダプター配列除去を行い、結果をhoge2に格納
    out <- hoge2[((hoge2@ranges@width >= min(param5)) & (hoge2@ranges@width <= max(param5))),]#hoge2の中からparam5で指定した配列長の条件を満たすもののみ抽出してoutに格納
    count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(out))[,1:4]) #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
    out2 <- out[out@ranges@width == count]                       #各readの長さ（out@ranges@width）とcountの結果を比較して、同じ長さもののみout2に格納
    names(out2) <- paste(param4, 1:length(out2), sep="_")        #(multi-)FASTA形式のdescription部分を作成している
    writeXStringSet(out2, file=out_f, format="fasta", width=80)  #out2の中身をout_fで指定したファイル名で保存
}

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#out中の配列群について、配列長別に何readsあったかをカウントしてファイルに出力したい場合：
out_f2 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out2 <- NULL                                                     #最終的にout2という名前で結果を得るためのプレースホルダー（おまじない）
hoge <- out@ranges@width                                         #以下のプログラムを見やすくするために配列長のベクトル（out@ranges@width）をhogeに格納（hogeとして取り扱っているだけ）
for(i in min(hoge):max(hoge)){                                   #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
    out2 <- rbind(out2, c(i, sum(hoge == i)))                    #配列長iの数をカウントした結果をout2に格納している
}                                                                #配列長の最小値から最大値まで1刻みでループを回す
colnames(out2) <- c("length", "count")                           #得られたout2の1列目は配列長情報、2列目はその配列長だったread数に相当するので、列名をそのように与えている
write.table(out2, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#out2の中身をout_f2で指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. デフォルトのパラメータ（一致に1点、不一致に-1点）を採用する場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge1.fastq"                                           #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納

#必要なパッケージをロード
library(girafe)                                                  #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- trimAdapter(readq, param1)                                #trimAdapter関数を用いてアダプター配列除去した結果をoutに格納

writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存
head(sread(readq))                                               #アダプター配列除去前の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
head(sread(out))                                                 #アダプター配列除去後の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
table(width(readq))                                              #アダプター配列除去前の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが500配列」という意味)
table(width(out))                                                #アダプター配列除去後の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが464配列, 33bpのものが8配列, ...」という意味)

------    ここまで    ------

2. paramで指定するアダプター配列と完全一致のみで且つ、最低2塩基以上一致しないとトリムしない場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge2.fastq"                                           #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納
param2 <- 2                                                      #アダプター配列との最低一致塩基数をparam2に格納

mismatch <- nchar(param1) + 100                                  #不一致に対して大幅に減点するための値を「アダプター配列長 + 100」としている(100を余分に足しているのは念のためです)

#必要なパッケージをロード
library(girafe)                                                  #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- trimAdapter(readq, param1, mismatch.score = -mismatch, score.threshold = param2)#trimAdapter関数を用いてアダプター配列除去した結果をoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存
head(sread(readq))                                               #アダプター配列除去前の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
head(sread(out))                                                 #アダプター配列除去後の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
table(width(readq))                                              #アダプター配列除去前の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが500配列」という意味)
table(width(out))                                                #アダプター配列除去後の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが487配列, 33bpのものが10配列, ...」という意味)

------    ここまで    ------

3. param1で指定するアダプター配列と完全一致のみで且つ、最低4塩基以上一致しないとトリムしない場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge3.fastq"                                           #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納
param2 <- 4                                                      #アダプター配列との最低一致塩基数をparam2に格納

mismatch <- nchar(param1) + 100                                  #不一致に対して大幅に減点するための値を「アダプター配列長 + 100」としている(100を余分に足しているのは念のためです)

#必要なパッケージをロード
library(girafe)                                                  #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- trimAdapter(readq, param1, mismatch.score = -mismatch, score.threshold = param2)#trimAdapter関数を用いてアダプター配列除去した結果をoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存
head(sread(readq))                                               #アダプター配列除去前の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
head(sread(out))                                                 #アダプター配列除去後の塩基配列(の一部)を表示させてるだけ
table(width(readq))                                              #アダプター配列除去前の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが500配列」という意味)
table(width(out))                                                #アダプター配列除去後の塩基配列の配列長を示しているだけ(「35bpのものが498配列, 31bpのものが2配列」という意味)

------    ここまで    ------

1. 基本形（2塩基ミスマッチまで許容してFASTA形式で出力したい場合）：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge1.fa"                                              #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納
param2 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam2に格納

#必要なパッケージをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番（アダプター配列除去）
out <- trimLRPatterns(Rpattern=param1, subject=sread(readq), max.Rmismatch=rep(param2, nchar(param1)))#アダプター配列除去を行った結果をoutに格納
names(out) <- id(readq)                                          #description部分の記述をid(reads)で与えている

#FASTA形式で出力
tmp <- out                                                       #outの中身をtmpにコピーしているだけ
writeXStringSet(tmp, file=out_f, format="fasta", width=50)       #tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

2. 上記1.のミスマッチ数指定に加え、アダプター配列除去後の配列長の範囲(23bp-30bp)を指定したい場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge2.fa"                                              #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納
param2 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam2に格納
param3 <- c(23, 30)                                              #RNA配列長の最小と最大値を指定してparam3に格納

#必要なパッケージをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#アダプター配列除去
out <- trimLRPatterns(Rpattern=param1, subject=sread(readq), max.Rmismatch=rep(param2, nchar(param1)))#アダプター配列除去を行った結果をoutに格納
names(out) <- id(readq)                                          #description部分の記述をid(reads)で与えている

#指定した配列長条件によるフィルタリング
obj <- ((width(out) >= min(param3)) & (width(out) <= max(param3)))#条件を満たす配列長を持つ要素をTRUE、それ以外をFALSEとした論理値ベクトルobjを作成
out2 <- out[obj]                                                 #objがTRUEとなる要素のみ抽出した結果をout2に格納

#FASTA形式で出力
tmp <- out2                                                      #out2の中身をtmpにコピーしているだけ
writeXStringSet(tmp, file=out_f, format="fasta", width=50)       #tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

3. 上記2.の「ミスマッチ数と配列長の範囲」指定に加え、ACGTのみからなる配列のみを抽出したい場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge3.fa"                                              #アダプター配列除去後の出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- "CATCGATCCTGCAGGCTAGAGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG"#アダプター配列情報を指定してparam1に格納
param2 <- 2                                                      #許容するミスマッチの数を指定してparam2に格納
param3 <- c(23, 30)                                              #RNA配列長の最小と最大値を指定してparam3に格納

#必要なパッケージをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#FASTQ形式ファイルの読み込み
readq <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番（アダプター配列除去）
out <- trimLRPatterns(Rpattern=param1, subject=sread(readq), max.Rmismatch=rep(param2, nchar(param1)))#アダプター配列除去を行った結果をoutに格納
names(out) <- id(readq)                                          #description部分の記述をid(reads)で与えている

#指定した配列長条件によるフィルタリング
obj <- ((width(out) >= min(param3)) & (width(out) <= max(param3)))#条件を満たす配列長を持つ要素をTRUE、それ以外をFALSEとした論理値ベクトルobjを作成
out2 <- out[obj]                                                 #objがTRUEとなる要素のみ抽出した結果をout2に格納

#ACGTのみからなるもの（Nなどを含まない）をフィルタリング
count <- rowSums(alphabetFrequency(DNAStringSet(out2))[,1:4])    #各readについてACGTの総数をカウントし、結果をcountに格納
out3 <- out2[width(out2) == count]                               #各readの長さwidth(out2)とcountの結果を比較して、同じ長さもののみout3に格納

#FASTA形式で出力
tmp <- out3                                                      #out3の中身をtmpにコピーしているだけ
writeXStringSet(tmp, file=out_f, format="fasta", width=50)       #tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

1. 「8番染色体上の+鎖のみにマップされたもののみ」の場合のやり方1：
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "chr08"                                                #染色体の条件
param2 <- "+"                                                    #strandの条件

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：フィルタリング
output <- output[output@chromosome == param1]                    #param1で指定した染色体の情報のみ抽出して、readsに格納
output <- output[output@strand == "+"]                           #param2で指定したstrandのもののみ抽出して、readsに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
reads <- sread(output)                                           #outputで得られたオブジェクトから塩基配列情報をDNAStringSetオブジェクトとして得たい場合

------    ここまで    ------

2. 「8番染色体上の+鎖のみにマップされたもののみ」の場合のやり方2：
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "chr08"                                                #染色体の条件
param2 <- "+"                                                    #strandの条件

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：フィルタリング
filter <- compose(chromosomeFilter(param1), strandFilter(param2))#param1 and param2で指定したフィルタリング条件をまとめてfilterに格納
output <- output[filter(output)]                                 #フィルタリングを実行して、その結果をreadsに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
reads <- sread(output)                                           #outputで得られたオブジェクトから塩基配列情報をDNAStringSetオブジェクトとして得たい場合

------    ここまで    ------

3. 「strandは気にせずに10番染色体上にマップされたもののみ」の場合：
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "chr10"                                                #染色体の条件

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：フィルタリング
filter <- compose(chromosomeFilter(param1))                      #param1で指定したフィルタリング条件をまとめてfilterに格納
output <- output[filter(output)]                                 #フィルタリングを実行して、その結果をreadsに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
reads <- sread(output)                                           #outputで得られたオブジェクトから塩基配列情報をDNAStringSetオブジェクトとして得たい場合

------    ここまで    ------

4. 「マップされた染色体全てについてマップされたリード数などの基礎情報を取得」の場合：
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "output.hoge"                                           #出力ファイル名を指定

#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：基礎情報取得
unique_chr <- sort(unique(output@chromosome))                    #マップされた染色体情報を取得してunique_chrに格納
out <- NULL                                                      #おまじない
for(j in 1:length(unique_chr)){                                  #unique_chr中の染色体数分だけループを回す
    output_sub <- output[output@chromosome == unique_chr[j]]     #特定の染色体上にマップされたもののみ抽出してoutput_subに格納
    out <- rbind(out, c(unique_chr[j], length(output_sub)))      #染色体名(unique_chr[j])とその染色体上にマップされたリード数(length(output_sub))をまとめてoutに格納
}
colnames(out) <- c("chromosome_name", "reads_mapped")            #列名を左記のように与えている
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

5. 「4. マップされた染色体全てについてマップされたリード数などの基礎情報を取得」の出力ファイル名の自動作成(拡張子.hoge)版：
割と便利なので備忘録的に掲載しておきます。
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
param <- "hoge"                                                  #出力ファイル名の拡張子を指定

out_f <- paste(unlist(strsplit(in_f, ".", fixed=TRUE))[1], param, sep=".")                  #出力ファイル名を作成してout_fに格納
#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：基礎情報取得
unique_chr <- sort(unique(output@chromosome))                    #マップされた染色体情報を取得してunique_chrに格納
out <- NULL                                                      #おまじない
for(j in 1:length(unique_chr)){                                  #unique_chr中の染色体数分だけループを回す
    output_sub <- output[output@chromosome == unique_chr[j]]     #特定の染色体上にマップされたもののみ抽出してoutput_subに格納
    out <- rbind(out, c(unique_chr[j], length(output_sub)))      #染色体名(unique_chr[j])とその染色体上にマップされたリード数(length(output_sub))をまとめてoutに格納
}
colnames(out) <- c("chromosome_name", "reads_mapped")            #列名を左記のように与えている
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

6. 「5」を基本形として、さらにstrand(+ or -)別の情報を追加したもの：
割と便利なので備忘録的に掲載しておきます。
------    ここから    ------
in_f <- "output.soap"                                            #読み込みたいSOAP出力ファイル名を指定してin_fに格納
param <- "hoge"                                                  #出力ファイル名の拡張子を指定

out_f <- paste(unlist(strsplit(in_f, ".", fixed=TRUE))[1], param, sep=".")                  #出力ファイル名を作成してout_fに格納
#第1段階：マップ後のファイルの読み込み
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
output <- readAligned(in_f, type="SOAP")                         #in_fで指定したファイルの読み込み

#第2段階：基礎情報取得
unique_chr <- sort(unique(output@chromosome))                    #マップされた染色体情報を取得してunique_chrに格納
out <- NULL                                                      #おまじない
for(j in 1:length(unique_chr)){                                  #unique_chr中の染色体数分だけループを回す
    output_sub <- output[output@chromosome == unique_chr[j]]     #特定の染色体上にマップされたもののみ抽出してoutput_subに格納
    output_sub_f <- output_sub[output_sub@strand == "+"]         #output_subの中で"+"鎖上にマップされたものをoutput_sub_fに格納
    output_sub_r <- output_sub[output_sub@strand == "-"]         #output_subの中で"-"鎖上にマップされたものをoutput_sub_rに格納
    out <- rbind(out, c(unique_chr[j],length(output_sub),length(output_sub_f),length(output_sub_r)))#「染色体名(unique_chr[j])」、「その染色体上にマップされたリード数(length(output_sub))」、「+鎖上に...」、「-鎖上に...」をまとめてoutに格納
}
colnames(out) <- c("chromosome_name", "reads_mapped", "reads_mapped(+)", "reads_mapped(-)")            #列名を左記のように与えている
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#outの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

やり方1 (ASCIIコードからPHREDスコアに変換してその数値情報をタブ区切りテキストファイルで保存したい場合)：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439.txt"                                         #出力ファイル名を指定してout_fに格納

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
out <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
qscore <- as(quality(out), "matrix")                             #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
dim(qscore)                                                      #qscoreの行数と列数を確認しているだけ
rownames(qscore) <- serial                                       #qscoreの行名をserialで与えている
colnames(qscore) <- 1:ncol(qscore)                               #qscoreの列名を1:ncol(qscore)の数値ベクトルで与えている

tmp <- cbind(serial, qscore)                                     #qscore行列の左側にserialを結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

やり方2 (ASCIIコードからPHREDスコアに変換した結果の分布をboxplotで描きたい場合)：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
out <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
qscore <- as(quality(out), "matrix")                             #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
rownames(qscore) <- serial                                       #qscoreの行名をserialで与えている
colnames(qscore) <- 1:ncol(qscore)                               #qscoreの列名を1:ncol(qscore)の数値ベクトルで与えている
boxplot(as.data.frame(qscore), outline=FALSE, xlab="cycle number", ylab="PHRED score")#qscoreをdata.frame形式にしてboxplotを描画(outline=FALSEの意味は、外れ値を描画しない、です。)

------    ここまで    ------

やり方3 (ASCIIコードからPHREDスコアに変換した結果の分布をboxplotでpngファイルに保存したい場合)：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439.png"                                         #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- 600                                                    #横幅（width; 単位はピクセル）を指定
param2 <- 400                                                    #縦幅（height; 単位はピクセル）を指定
param3 <- 13                                                     #文字の大きさ（単位はpoint）を指定

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
out <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
qscore <- as(quality(out), "matrix")                             #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
rownames(qscore) <- serial                                       #qscoreの行名をserialで与えている
colnames(qscore) <- 1:ncol(qscore)                               #qscoreの列名を1:ncol(qscore)の数値ベクトルで与えている

png(out_f, pointsize=param3, width=param1, height=param2)        #出力ファイルの各種パラメータを指定
boxplot(as.data.frame(qscore), outline=FALSE, xlab="cycle number", ylab="PHRED score")#qscoreをdata.frame形式にしてboxplotを描画(outline=FALSEの意味は、外れ値を描画しない、です。)
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

1. PHREDスコアが20未満のものがリード長に占める割合が0.1以上のリードを除去する場合：
(例題のファイル中のリードは全て35bpのリードである。その10%以上ということで実質的にPHREDスコアが閾値未満のものが4塩基以上あるリードはダメ、ということになる)
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_f.fastq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- 20                                                     #PHREDスコアの閾値を指定
param2 <- 0.1                                                    #指定した閾値未満のものがリード長に占める割合を指定

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
hoge2 <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをhoge2に格納
qscore <- as(quality(hoge2), "matrix")                           #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
obj <- (rowSums(qscore < param1) <= width(hoge2)*param2)         #param1およびparam2で指定した条件を満たすリードをTRUE、そうでないものをFALSEとしたものをobjに格納
nrow(qscore)                                                     #qscoreの行数を表示させてもともとのリード数を表示させてるだけ
sum(obj)                                                         #obj中のTRUEの要素数(除去されずに残ったリード数)を表示させてるだけ
out <- hoge2[obj]                                                #hoge2の中からobj中の要素がTRUEのもののみ抽出した結果をoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

2. 各リードに対するPHREDスコアが20以上の塩基数が0.9より多いリードのみ抽出したい場合：
(1と同じことを別の言葉で表現しているだけです。)
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_f.fastq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- 20                                                     #PHREDスコアの閾値を指定
param2 <- 0.9                                                    #指定した閾値以上の塩基数の各リードに占める割合を指定

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
hoge2 <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをhoge2に格納
qscore <- as(quality(hoge2), "matrix")                           #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
obj <- (rowSums(qscore >= param1) > width(hoge2)*param2)         #param1およびparam2で指定した条件を満たすリードをTRUE、そうでないものをFALSEとしたものをobjに格納
nrow(qscore)                                                     #qscoreの行数を表示させてもともとのリード数を表示させてるだけ
sum(obj)                                                         #obj中のTRUEの要素数(除去されずに残ったリード数)を表示させてるだけ
out <- hoge2[obj]                                                #hoge2の中からobj中の要素がTRUEのもののみ抽出した結果をoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------
#3. 各リードに対するPHREDスコアが任意の閾値以上の塩基数をまずは自分で眺めたい場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_f.txt"                                       #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- 20                                                     #PHREDスコアの閾値を指定

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
hoge2 <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをhoge2に格納
qscore <- as(quality(hoge2), "matrix")                           #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
obj_num <- rowSums(qscore >= param1)                             #param1で指定した条件を満たすリードごとの塩基数をobj_numに格納
obj_percent <- 100*obj_num/width(hoge2)                          #obj_num中の塩基数をパーセンテージに変換したものをobj_percentに格納
tmp <- cbind(serial, width(hoge2), obj_num, obj_percent)         #「リードのシリアル番号」、「リードの長さ」、「obj_num」、「obj_percent」を列方向に結合したものをtmpに格納
colnames(tmp) <- c("serial", "read_length", "nucleotide_number", "percentage")#tmpに対して任意の列名を与えている
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "SRR037439_f.fastq"                                     #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param1 <- 20                                                     #PHREDスコアの閾値を指定
param2 <- "N"                                                    #置換後の文字を指定

library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads)), " ", fixed=TRUE)       #id(reads)中の文字列を" "で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
serial <- sapply(hoge,"[[", 1)                                   #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してserialに格納
hoge2 <- ShortReadQ(sread(reads), quality(reads), BStringSet(serial))#ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをhoge2に格納
qscore <- as(quality(hoge2), "matrix")                           #ASCIIコードのquality scoreをPHRED scoreに変換し、データ構造をmatrixにした結果をqscoreに格納
at <- qscore < param1                                            #param1で指定した条件を満たす塩基をTRUE、そうでないものをFALSEとした結果をatに格納
hoge3 <- DNAString(paste(rep(param2, width(hoge2)[1]), collapse=""))#「リード長がwidth(hoge2)[1]」で「全ての塩基がparam2で指定した文字」からなるDNAStringオブジェクトを作成してhoge3に格納(この場合Nが35個からなる塩基配列に相当)
letter <- as(Views(hoge3, start=1, end=rowSums(at)), "DNAStringSet")#rowSums(at)で各リードごとのPHREDスコアが閾値未満の塩基数がわかるので、その塩基数分からなるparam2の文字のDNAStringSetオブジェクトを作成してletterに格納
hoge4 <- replaceLetterAt(sread(hoge2), at, letter)               #atやletterを作成したのは、ここで用いている目的のreplaceLetterAt関数がそれらの情報を用いて該当塩基部分の置換を行うからです
out <- ShortReadQ(hoge4, quality(reads), BStringSet(serial))     #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
sread(out)                                                       #sread(out)の中身を表示させてるだけ(Nが増えているのがわかる; hoge4でも同じ)
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f1 <- "read1.fq"                                              #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "read2.fq"                                              #読み込みたいFASTQ形式のファイル名を指定してin_f2に格納
out_f1 <- "read1_pf.fq"                                          #出力ファイル名を指定してout_f1に格納
out_f2 <- "read2_pf.fq"                                          #出力ファイル名を指定してout_f2に格納

library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#read1について基本情報取得
reads1 <- readFastq(in_f1)                                       #in_f1で指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads1)), "/", fixed=TRUE)      #id(reads1)中の文字列を"/"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- sapply(hoge,"[[", 1)                                    #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してhoge2に格納
hoge3 <- strsplit(hoge2, ":", fixed=TRUE)                        #hoge2中の文字列を":"で区切った結果をリスト形式でhoge3に格納
pass_filter1 <- sapply(hoge3,"[[", length(hoge3[[1]]))           #hoge3のリスト中の最後の要素のみ取り出してpass_filter1に格納
tmp_serial1 <- hoge2                                             #入力ファイルのIDの順番がファイル間で同じかどうかを確かめるためにhoge2情報をtmp_serial1に格納

#read2について基本情報取得
reads2 <- readFastq(in_f2)                                       #in_f2で指定したファイルの読み込み
hoge <- strsplit(as.character(id(reads2)), "/", fixed=TRUE)      #id(reads2)中の文字列を"/"で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
hoge2 <- sapply(hoge,"[[", 1)                                    #hogeのリスト中の一番目の要素のみ取り出してhoge2に格納
hoge3 <- strsplit(hoge2, ":", fixed=TRUE)                        #hoge2中の文字列を":"で区切った結果をリスト形式でhoge3に格納
pass_filter2 <- sapply(hoge3,"[[", length(hoge3[[1]]))           #hoge3のリスト中の最後の要素のみ取り出してpass_filter2に格納
tmp_serial2 <- hoge2                                             #入力ファイルのIDの順番がファイル間で同じかどうかを確かめるためにhoge2情報をtmp_serial2に格納

#入力ファイルの状態を念のため確認している
#Step1:二つのファイル間でIDの総数が同じかどうかをチェック
#Step2:二つのファイル間でID情報のpass filterの部分より左側のところのみが同じかどうかをチェック
flag <- 0
if(length(tmp_serial1) == length(tmp_serial2)){
    print("Step1:OK")
    flag <- 1
    if(length(tmp_serial1) == sum(tmp_serial1 == tmp_serial2)){
        print("Step2:OK")
        flag <- 2
    }else{
        print("Step2:IDs between two paired-end files are not ideltical!")
    }
}else{
    print("Step1:The two files are not paired-end!")
}

#本番：二つのファイル間でpass filteringフラグが1のもののみ抽出する
if(flag == 2){
    hoge_flag <- as.integer(pass_filter1) + as.integer(pass_filter2)#IDごとにpass filteringフラグの和を計算した結果をhoge_flagに格納（両方で1のものは2になる）
    length(hoge_flag)                                            #フィルタリング前のリード数を表示
    sum(hoge_flag == 2)                                          #フィルタリング後のリード数を表示
    writeFastq(reads1[hoge_flag == 2], out_f1)                   #reads1の中からhoge_flagの値が2となるもののみout_f1で指定したファイル名で保存
    writeFastq(reads2[hoge_flag == 2], out_f2)                   #reads2の中からhoge_flagの値が2となるもののみout_f2で指定したファイル名で保存
}

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- ""                                                       #読み込みたいファイル名を指定してin_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(htSeqTools)                                              #パッケージの読み込み

------    ここまで    ------

1. hoge4.faファイルの場合(FASTA形式):
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #multi-fasta形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge_out.fa"                                           #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #3'末端のトリムしたい塩基数
param2 <- 20                                                     #トリム後に出力する配列長の閾値（ここで指定した数値以上の長さのものが出力される）

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#塩基配列データファイルの読み込みとトリム
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
hoge <- DNAStringSet(reads, start=1, end=(width(reads)-param1))         #readsオブジェクトの中から(param1)塩基だけトリムした結果をDNAStringSet形式にしてhogeに格納
out <- hoge[width(hoge) >= param2]                               #(param2)で指定した配列長以上、という条件を満たすリードのみ抽出してoutに格納
writeXStringSet(out, file=out_f, format="fasta", width=60)       #一行あたりの塩基数を60bpにして、out_fで指定したファイル名でoutというオブジェクトをFASTA形式で保存

------    ここまで    ------

2. SRR037439.fastqファイルの場合(FASTQ形式):
------    ここから    ------
in_f <- "SRR037439.fastq"                                        #FASTQ形式の入力ファイルを指定
out_f <- "hoge_out2.fq"                                          #出力ファイル名を指定
param1 <- 2                                                      #3'末端のトリムしたい塩基数
param2 <- 30                                                     #トリム後に出力する配列長の閾値（ここで指定した数値以上の長さのものが出力される）

#必要なパッケージなどをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#塩基配列データファイルの読み込みとトリム
reads <- readFastq(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込み
hoge1 <- DNAStringSet(sread(reads), start=1, end=width(sread(reads))-param1)#sread(reads)オブジェクトの中から(param1)塩基だけトリムした結果をDNAStringSet形式にしてhoge1に格納
hoge2 <- BStringSet(quality(quality(reads)), start=1, end=width(quality(quality(reads)))-param1)#quality(reads)オブジェクトの中から(param1)塩基だけトリムした結果をDNAStringSet形式にしてhoge2に格納

#トリム後の配列長でフィルタリング
hoge1.f <- hoge1[width(hoge1) >= param2]                         #(param2)で指定した配列長以上、という条件を満たすもののみ抽出してhoge1.fに格納
hoge2.f <- hoge2[width(hoge1) >= param2]                         #(param2)で指定した配列長以上、という条件を満たすもののみ抽出してhoge2.fに格納
hoge3.f <- BStringSet(as.character(id(reads)))[width(hoge1) >= param2]#(param2)で指定した配列長以上、という条件を満たすもののみ抽出してhoge3.fに格納

#FASTQ形式に再び戻してファイル出力
out <- ShortReadQ(hoge1.f, hoge2.f, hoge3.f)                     #ReadFastQ関数を用いてReadFastQというクラスオブジェクトを一から作成したものをoutに格納
writeFastq(out, out_f)                                           #オブジェクトoutをFASTQ形式で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "Trinity.fasta"                                          #読み込みたいファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "output.txt"                                            #出力ファイル名を指定してout_fに格納

library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルをFASTA形式で読み込み
hoge <- strsplit(names(reads), " ", fixed=TRUE)                  #names(reads)中の文字列をスペース（" "）で区切った結果をリスト形式でhogeに格納
contigID <- unlist(lapply(hoge, "[[", 1))                        #hogeのリスト中の1番目の要素(コンティグID部分に相当)のみ抽出してcontigIDに格納
hoge2 <- unlist(lapply(hoge, "[[", 3))                           #hogeのリスト中の3番目の要素(FPKM部分に相当)のみ抽出してhoge2に格納
hoge3 <- strsplit(hoge2, "=", fixed=TRUE)                        #hoge2中の文字列を"="で区切った結果をリスト形式でhoge3に格納
FPKM <- unlist(lapply(hoge3, "[[", 2))                           #hoge3のリスト中の2番目の要素(FPKMの実際の値部分に相当)のみ抽出してFPKMに格納
transcript_length <- width(reads)                                #配列長情報をtranscript_lengthに格納
tmp <- cbind(contigID, FPKM, transcript_length)                  #「コンティグID」、「FPKM値」、「配列長」を結合してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. マップされる側の配列（hoge4.fa）中のIDの並びでBED形式ファイル(sample_1.bed)中の出現回数をカウントする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "sample_1.bed"                                          #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "hoge4.fa"                                              #マップに用いたリファレンス配列のファイル名を指定してin_f2に格納
out_f <- "output1.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込みと必要な情報の抽出など
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルを読み込んでreadsに格納
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t")                 #in_f1で指定したファイルを読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
out <- rle(sort(ID_list))                                        #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をoutに格納

#本番
rawcount <- rep(0, length(reads))                                #最終的に欲しいrawcount値の初期値を0にしておく
names(rawcount) <- names(reads)                                  #names(reads)をnames(rawcount)に格納
hoge <- out$lengths                                              #outオブジェクト中のカウント情報をhogeに格納
names(hoge) <- out$values                                        #outオブジェクト中のID情報をnames(hoge)に格納
obj <- is.element(names(rawcount), names(hoge))                  #names(rawcount)の並び順でnames(hoge)中のIDが存在する位置にTRUEを、そうでない位置にはFALSEを返した結果をobjに格納
common <- intersect(names(rawcount), names(hoge))                #names(rawcount)とnames(hoge)中の積集合をcommonに格納
rawcount[obj] <- hoge[common]                                    #objがTRUEの位置に生リードカウントを代入

#ファイル出力
tmp <- cbind(names(reads), rawcount)                             #結果ファイルの1列目がID, 2列目がcount情報になるようにしたものをtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

2. マップされる側の配列（hoge4.fa）中のIDの並びでBED形式ファイル(sample_1.bed)中の出現回数をカウントする場合(1.と同じだが、若干異なる手順にしている)：
------    ここから    ------
in_f1 <- "sample_1.bed"                                          #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "hoge4.fa"                                              #マップに用いたリファレンス配列のファイル名を指定してin_f2に格納
out_f <- "output2.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込みと必要な情報の抽出など
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルを読み込んでreadsに格納
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t")                 #in_f1で指定したファイルを読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
out <- rle(sort(ID_list))                                        #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をoutに格納

#本番
rawcount <- rep(0, length(reads))                                #最終的に欲しいrawcount値の初期値を0にしておく
names(rawcount) <- sort(names(reads))                            #sort(names(reads))をnames(rawcount)に格納
hoge <- out$lengths                                              #outオブジェクト中のカウント情報をhogeに格納
names(hoge) <- out$values                                        #outオブジェクト中のID情報をnames(hoge)に格納
obj <- is.element(names(rawcount), names(hoge))                  #names(rawcount)の並び順でnames(hoge)中のIDが存在する位置にTRUEを、そうでない位置にはFALSEを返した結果をobjに格納
rawcount[obj] <- hoge                                            #objがTRUEの位置に生リードカウントを代入

#ファイル出力（この段階でin_f2で読み込んだファイルのIDの並びに変更している）
tmp <- cbind(names(reads), rawcount[names(reads)])               #結果ファイルの1列目がID, 2列目がcount情報になるようにしたものをtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------


3. マップされる側の配列（h_rna.fasta）中のIDの並びでBED形式ファイル(SRR002324_t.bed)中の出現回数をカウントする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SRR002324_t.bed"                                       #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "h_rna.fasta"                                           #マップに用いたリファレンス配列のファイル名を指定してin_f2に格納
out_f <- "output3.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージなどをロード
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込みと必要な情報の抽出など
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルを読み込んでreadsに格納
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, sep="\t")                 #in_f1で指定したファイルを読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
out <- rle(sort(ID_list))                                        #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をoutに格納

#本番
rawcount <- rep(0, length(reads))                                #最終的に欲しいrawcount値の初期値を0にしておく
names(rawcount) <- names(reads)                                  #names(reads)をnames(rawcount)に格納
hoge <- out$lengths                                              #outオブジェクト中のカウント情報をhogeに格納
names(hoge) <- out$values                                        #outオブジェクト中のID情報をnames(hoge)に格納
obj <- is.element(names(rawcount), names(hoge))                  #names(rawcount)の並び順でnames(hoge)中のIDが存在する位置にTRUEを、そうでない位置にはFALSEを返した結果をobjに格納
common <- intersect(names(rawcount), names(hoge))                #names(rawcount)とnames(hoge)中の積集合をcommonに格納
rawcount[obj] <- hoge[common]                                    #objがTRUEの位置に生リードカウントを代入

#ファイル出力
tmp <- cbind(names(reads), rawcount)                             #結果ファイルの1列目がID, 2列目がcount情報になるようにしたものをtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

4. マップされる側の配列（h_rna.fasta）中のIDをソートした並びでBED形式ファイル(SRR002324_t.bed)中の出現回数をカウントする場合：
基本的に2.の記述と同じで、最後のファイル出力のところでalphabet順にソートしたままの状態で出力しているだけです。
------    ここから    ------
in_f1 <- "SRR002324_t.bed"                                       #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "h_rna.fasta"                                           #マップに用いたリファレンス配列のファイル名を指定してin_f2に格納
out_f <- "output4.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#BEDファイル中に出現するIDのみ、アルファベット順にソートして生リード数をカウント
data <- read.table(in_f1)                                        #in_f1で指定したファイルを読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
out <- rle(sort(ID_list))                                        #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をoutに格納

#マップされる側のファイルのID情報を抽出
library(ShortRead)                                               #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルを読み込んでreadsに格納

#本番
rawcount <- rep(0, length(reads))                                #最終的に欲しいrawcount値の初期値を0にしておく
names(rawcount) <- sort(names(reads))                            #sort(names(reads))をnames(rawcount)に格納
hoge <- out$lengths                                              #outオブジェクト中のカウント情報をhogeに格納
names(hoge) <- out$values                                        #outオブジェクト中のID情報をnames(hoge)に格納
obj <- is.element(names(rawcount), names(hoge))                  #names(rawcount)の並び順でnames(hoge)中のIDが存在する位置にTRUEを、そうでない位置にはFALSEを返した結果をobjに格納
rawcount[obj] <- hoge                                            #objがTRUEの位置に生リードカウントを代入

#ファイル出力
tmp <- cbind(names(rawcount), rawcount)                          #結果ファイルの1列目がID, 2列目がcount情報になるようにしたものをtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

5. BED形式ファイル(SRR002324_t.bed)中にあるIDのもののみ、アルファベット順にソートして出力する場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SRR002324_t.bed"                                        #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "output5.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

data <- read.table(in_f)                                         #in_fで指定したファイルの読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
out <- rle(sort(ID_list))                                        #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をoutに格納

#ファイル出力
tmp <- cbind(out$values, out$lengths)                            #結果ファイルの1列目がID, 2列目がcount情報になるようにしたものをtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f <- "ens_gene_46.txt"                                        #アノテーション情報ファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "ens_gene_46_length.txt"                                #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param <- "median"                                                #計算したい要約統計量を指定してparamに格納

tmp <- read.table(in_f, header=TRUE, sep="\t", quote="")         #アノテーション情報ファイルの読み込み
data <- na.omit(tmp)                                             #行列tmpからNAを含む行を削除した結果をdataに格納
transcript_len <- data[,4]                                       #Ensembl cDNA lengthに相当する列の情報をtranscript_lenに格納
ens_gene <- data[,1]                                             #Ensembl Gene IDに相当する列の情報をens_geneに格納
tmpout <- tapply(transcript_len, ens_gene, param)                #Ensembl Gene IDが同じものに対して、paramで指定した要約統計量を計算した結果をtmpoutに格納
out <- na.omit(as.data.frame(tmpout))                            #tmpout中には新たに生成されたNAが含まれる。これは「length情報がない」ものに対して要約統計量を計算した結果に相当するものである。したがって、新たにtmpoutに対してNAを含むものを削除した結果をoutに格納している

tmp <- cbind(rownames(out), out)                                 #Ensembl Gene IDと中央値の二つのベクトルを結合した結果をtmpに格納
colnames(tmp) <- c("Ensembl Gene ID", "Length")                  #行列tmpに任意の列名を与えている
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f1 <- "SRR002324_t.bed"                                       #読み込みたいBED形式ファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "h_rna.fasta"                                           #読み込みたいmulti-fastaファイル名を指定してin_f2に格納
out_f <- "output2.txt"                                           #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#0. 生リードカウントのところ
data <- read.table(in_f1)                                        #in_f1で指定したファイルの読み込んでdataに格納
ID_list <- as.vector(data[,1])                                   #行列dataから1列目の情報のみ抽出してベクトル形式にした結果をID_listに格納
hoge <- rle(sort(ID_list))                                       #どのIDがいくつあったかをカウントした結果をhogeに格納
rawcount <- hoge$lengths                                         #count情報をrawcountに格納
names(rawcount) <- hoge$values                                   #rawcountにnames属性を与えている(与えているのはID情報、つまりout$values)

#1. 配列長情報取得のところ
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルをFASTA形式で読み込み
trans_len <- width(reads)                                        #配列長情報をtrans_lenに格納
names(trans_len) <- names(reads)                                 #trans_lenにnames属性を与えている(与えているのはID情報、つまりnames(reads))
trans_len_s <- trans_len[order(names(trans_len))]                #trans_lenをIDのアルファベット順に並び替えた結果をtrans_len_sに格納

#2. IDの対応づけ
#背景：trans_len_sの要素数とrawcountの要素数は異なる。
#目的：trans_len_s中のIDの並びに対応した生リードカウントのベクトル情報、の取得
rawcount2 <- rep(0, length(trans_len_s))                         #目的のベクトル情報rawcount2のplaceholderを作成(初期値は0)
obj <- is.element(names(trans_len_s), names(rawcount))           #transl_len_sのIDの集合の中で、rawcount中のIDの集合に含まれるものはTRUEを、含まれないものはFALSEを返した結果をobjに格納
posi <- (1:length(obj))[obj]                                     #objの中身はTRUE or FALSEでしかないので、TRUEに相当する行番号情報を取得してposiに格納
rawcount2[posi] <- rawcount                                      #rawcount2ベクトル中のposiで与えた行番号の位置に、rawcountの値を順番に代入している
out <- cbind(trans_len_s, rawcount2)                             #trans_len_sとrawcount2の二つの列ベクトルを結合した結果をoutに格納
rownames(out) <- names(trans_len_s)                              #行列outの行名をnames(trans_len_s)で与えている
colnames(out) <- c("transcript_length", "raw_count")             #行列outの列名を与えている
tmp <- cbind(rownames(out), out)                                 #rownames(out)の列ベクトルを行列outの左側に結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

#3. 配列長と生のリードカウント数の箱ひげ図(boxplot)の作成
out_s <- out[order(out[,1]),]                                    #行列outを1列目でソートした結果をout_sに格納
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定
f <- gl(param, floor(nrow(out_s)/param)+1, nrow(out_s))          #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルをparam個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- out_s[,2]
y[y < 0.1] <- 0.1
plot(f, log10(y))                                                #transcript_length順でparam個に分割したときのfの各水準に対する生リード数の箱ひげ図を描く

------    ここまで    ------

1. edgeRを用い、TMM正規化を行わずにDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge1.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out_f2 <- "hoge1FDR.png"                                         #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている

tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- estimateCommonDisp(d)                                       #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でcommon dispersionを計算している
d <- estimateTagwiseDisp(d, prop.used=0.5, grid.length=500)      #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でmoderated tagwise dispersionを計算している
out <- exactTest(d)                                              #exact test (正確確率検定)で発現変動遺伝子を計算した結果をoutに格納
fdr <- p.adjust(out$table$PValue, method="BH")                  #False Discovery Rate (FDR)を計算し、結果をfdrに格納
names(fdr) <- rownames(data)                                     #FDR値とEnsembl Gene IDを対応づけている

common <- intersect(names(gene_length), names(fdr))              #二つのベクトル(names(gene_length)とnames(fdr))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_fdr <- is.element(names(fdr), common)                        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(fdr)中における位置情報をobj_fdrに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
fdr_sub <- fdr[obj_fdr]                                          #fdrベクトルの中から、obj_fdrがTRUEとなっているもののみ抽出してfdr_subに格納
tmp <- cbind(names(fdr_sub), data[obj_fdr,], gene_length_sub, fdr_sub)#配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「(Benjamini and Hochbergの方法で計算した)FDR値」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

lenfdr <- cbind(gene_length_sub, fdr_sub)                        #gene_length_subとfdr_subの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenfdrに格納。
lenfdr_s <- lenfdr[order(lenfdr[,1]),]                           #lenfdrを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenfdr_sに格納。
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
f <- gl(param, floor(nrow(lenfdr_s)/param)+1, nrow(lenfdr_s))    #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenfdr_s[,2]                                                #行列len_fdr_sの2列目の情報をyに格納

png(out_f2, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(f, y, xlab="gene length", ylab="FDR")                       #横軸がgene_length, 縦軸がFDRとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
out_f3 <- "hoge1DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- 0.1                                                    #FDRの閾値を指定
hoge <- rep(1, nrow(lenfdr_s))                                   #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #FDR情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとのFDRが閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

2. edgeRを用い、TMM正規化を行ったデータに対してDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge2.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out_f2 <- "hoge2FDR.png"                                         #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている

tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- calcNormFactors(d)                                          #TMM正規化係数を計算
d <- estimateCommonDisp(d)                                       #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でcommon dispersionを計算している
d <- estimateTagwiseDisp(d, prop.used=0.5, grid.length=500)      #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でmoderated tagwise dispersionを計算している
out <- exactTest(d)                                              #exact test (正確確率検定)で発現変動遺伝子を計算した結果をoutに格納
fdr <- p.adjust(out$table$PValue, method="BH")                  #False Discovery Rate (FDR)を計算し、結果をfdrに格納
names(fdr) <- rownames(data)                                     #FDR値とEnsembl Gene IDを対応づけている

common <- intersect(names(gene_length), names(fdr))              #二つのベクトル(names(gene_length)とnames(fdr))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_fdr <- is.element(names(fdr), common)                        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(fdr)中における位置情報をobj_fdrに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
fdr_sub <- fdr[obj_fdr]                                          #fdrベクトルの中から、obj_fdrがTRUEとなっているもののみ抽出してfdr_subに格納
tmp <- cbind(names(fdr_sub), data[obj_fdr,], gene_length_sub, fdr_sub)#配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「(Benjamini and Hochbergの方法で計算した)FDR値」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

lenfdr <- cbind(gene_length_sub, fdr_sub)                        #gene_length_subとfdr_subの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenfdrに格納。
lenfdr_s <- lenfdr[order(lenfdr[,1]),]                           #lenfdrを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenfdr_sに格納。
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
f <- gl(param, floor(nrow(lenfdr_s)/param)+1, nrow(lenfdr_s))    #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenfdr_s[,2]                                                #行列len_fdr_sの2列目の情報をyに格納

png(out_f2, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(f, y, xlab="gene length", ylab="FDR")                       #横軸がgene_length, 縦軸がFDRとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
out_f3 <- "hoge2DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- 0.1                                                    #FDRの閾値を指定
hoge <- rep(1, nrow(lenfdr_s))                                   #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #FDR情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとのFDRが閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

3. baySeqを用い、生リードカウントデータを入力として長さ補正なしでDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge3.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#生データの読み込み
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(baySeq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている

#配列長情報を得ている
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#baySeqを実行
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
libsizes <- rep(1000000, length(data.cl))                        #すでにTMM正規化したデータを読み込ませるので、baySeq内部で正規化を行わないようにするためのおまじない
groups <- list(NDE=rep(1, (param1+param2)), DE=data.cl)          #このデータセット中には発現変動遺伝子群(DE)とそうでないもの(NDE)が含まれているという情報をgroupsオブジェクトに格納
data1 <- new("countData", data=as.matrix(data), replicates=data.cl, libsizes=libsizes, groups=groups)#countDataオブジェクト形式にしてdata1に格納
data1P.NB <- getPriors.NB(data1, samplesize=5000, estimation="QL", cl=NULL)#事前パラメータの推定
out <- getLikelihoods.NB(data1P.NB, pET="BIC", cl=NULL)          #事後確率を計算
stat_out <- out@posteriors[,2]                                   #事後確率(0に近いほど変動している; 0が最大値)をstat_outに格納
rank_out <- rank(-stat_out)                                      #stat_outでランキングした結果をrank_outに格納
ratio_out <- out@estProps[2]                                     #全遺伝子中に占めるDEGの割合をratio_outに格納
names(rank_out) <- rownames(data)                                #ランキング結果とEnsembl Gene IDを対応づけている

#配列長情報がないEnsembl Gene IDのものもあるため、配列長情報があるもののみに限定
common <- intersect(names(gene_length), names(rank_out))         #二つのベクトル(names(gene_length)とnames(rank_out))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_rank_out <- is.element(names(rank_out), common)              #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(fdr)中における位置情報をobj_fdrに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
rank_out_sub <- rank_out[obj_rank_out]                           #fdrベクトルの中から、obj_rank_outがTRUEとなっているもののみ抽出してrank_out_subに格納
tmp <- cbind(names(rank_out_sub), data[obj_rank_out,], gene_length_sub, rank_out_sub)#配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「順位情報」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

lenrank <- cbind(gene_length_sub, rank_out_sub)                  #gene_length_subとrank_out_subの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenrankに格納。
lenrank_s <- lenrank[order(lenrank[,1]),]                        #lenrankを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenrank_sに格納。
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
f <- gl(param, floor(nrow(lenrank_s)/param)+1, nrow(lenrank_s))  #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenrank_s[,2]                                               #行列len_rank_sの2列目の情報をyに格納

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
out_f3 <- "hoge3DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- length(rank_out_sub)*ratio_out                         #「配列長をもつ全遺伝子数*DEGの割合」の順位までがDEGであるという情報をparam3に格納
hoge <- rep(1, nrow(lenrank_s))                                  #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #順位情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの順位が閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

4. baySeqを用い、TMM正規化を行ったデータに対して長さ補正なしでDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge4.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#生データの読み込み
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(baySeq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている

#TMM正規化データの作成
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- calcNormFactors(d)                                          #TMM正規化係数を計算
norm_f <- 1000000/(colSums(data)*d$samples$norm.factors)         #TMM正規化係数はRPM正規化とセットなので、最終的に各列に対して掛ける正規化係数はnorm_fで与えられる
RPM_TMM <- sweep(data, 2, norm_f, "*")                           #TMM正規化後のデータをRPM_TMMとして格納
data <- round(RPM_TMM)                                           #以下ではRPM_TMMをdataとして取り扱うが、baySeqは整数値のみしか取り扱わないのでRPM_TMM中の小数点以下の数値を丸めた結果をdataとしている

#配列長情報を得ている
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#baySeqを実行
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
libsizes <- rep(1000000, length(data.cl))                        #すでにTMM正規化したデータを読み込ませるので、baySeq内部で正規化を行わないようにするためのおまじない
groups <- list(NDE=rep(1, (param1+param2)), DE=data.cl)          #このデータセット中には発現変動遺伝子群(DE)とそうでないもの(NDE)が含まれているという情報をgroupsオブジェクトに格納
data1 <- new("countData", data=as.matrix(data), replicates=data.cl, libsizes=libsizes, groups=groups)#countDataオブジェクト形式にしてdata1に格納
data1P.NB <- getPriors.NB(data1, samplesize=5000, estimation="QL", cl=NULL)#事前パラメータの推定
out <- getLikelihoods.NB(data1P.NB, pET="BIC", cl=NULL)          #事後確率を計算
stat_out <- out@posteriors[,2]                                   #事後確率(0に近いほど変動している; 0が最大値)をstat_outに格納
rank_out <- rank(-stat_out)                                      #stat_outでランキングした結果をrank_outに格納
ratio_out <- out@estProps[2]                                     #全遺伝子中に占めるDEGの割合をratio_outに格納
names(rank_out) <- rownames(data)                                #ランキング結果とEnsembl Gene IDを対応づけている

#配列長情報がないEnsembl Gene IDのものもあるため、配列長情報があるもののみに限定
common <- intersect(names(gene_length), names(rank_out))         #二つのベクトル(names(gene_length)とnames(rank_out))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_rank_out <- is.element(names(rank_out), common)              #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(fdr)中における位置情報をobj_fdrに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
rank_out_sub <- rank_out[obj_rank_out]                           #fdrベクトルの中から、obj_rank_outがTRUEとなっているもののみ抽出してrank_out_subに格納
tmp <- cbind(names(rank_out_sub), data[obj_rank_out,], gene_length_sub, rank_out_sub)#配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「順位情報」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

lenrank <- cbind(gene_length_sub, rank_out_sub)                  #gene_length_subとrank_out_subの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenrankに格納。
lenrank_s <- lenrank[order(lenrank[,1]),]                        #lenrankを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenrank_sに格納。
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
f <- gl(param, floor(nrow(lenrank_s)/param)+1, nrow(lenrank_s))  #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenrank_s[,2]                                               #行列len_rank_sの2列目の情報をyに格納

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
out_f3 <- "hoge4DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- length(rank_out_sub)*ratio_out                         #「配列長をもつ全遺伝子数*DEGの割合」の順位までがDEGであるという情報をparam3に格納
hoge <- rep(1, nrow(lenrank_s))                                  #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #順位情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの順位が閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

5. baySeqを用い、配列長情報があるもののみの生リードカウントデータを入力として長さ補正なしでDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge5.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えて発現データ(data)情報を取得
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(baySeq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてgene_length情報を取得
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#gene_length情報があり、かつ発現データファイル中にもあるEnsembl Gene IDのもののみ取り扱うための処理
common <- intersect(names(gene_length), rownames(data))          #二つのベクトル(names(gene_length)とrownames(data))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_data <- is.element(rownames(data), common)                   #commonで指定したEnsembl Gene IDsのrownames(data)中における位置情報をobj_dataに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
data_sub <- data[obj_data,]                                      #行列dataからobj_dataがTRUEとなっている行のみ抽出してdata_subに格納

#元々あった遺伝子数がどの程度の数になったかを表示
dim(data)                                                        #行列dataの行数と列数を表示
dim(data_sub)                                                    #行列data_subの行数と列数を表示
gene_length <- gene_length_sub                                   #gene_lengthの中身をgene_length_subにしている
data <- as.matrix(data_sub)                                      #dataの中身をmatrix形式のdata_subにしている

#baySeqを実行
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
groups <- list(NDE=rep(1, (param1+param2)), DE=data.cl)          #このデータセット中には発現変動遺伝子群(DE)とそうでないもの(NDE)が含まれているという情報をgroupsオブジェクトに格納
data1 <- new("countData", data=data, replicates=data.cl, libsizes=as.integer(colSums(data)), groups=groups)#countDataオブジェクト形式にしてdata1に格納
data1P.NB <- getPriors.NB(data1, samplesize=5000, estimation="QL", cl=NULL)#事前パラメータの推定
out <- getLikelihoods.NB(data1P.NB, pET="BIC", cl=NULL)          #事後確率を計算
out@estProps                                                     #発現変動(DE)遺伝子がデータの中にどの程度含まれていたかを表示（右側の数値；ちなみに左側の数値はNDEの割合を示す）
stat_out <- out@posteriors[,2]                                   #事後確率(0に近いほど変動している; 0が最大値)をstat_outに格納
rank_out <- rank(-stat_out)                                      #stat_outでランキングした結果をrank_outに格納
ratio_out <- out@estProps[2]                                     #全遺伝子中に占めるDEGの割合をratio_outに格納
names(rank_out) <- rownames(data)                                #ランキング結果とEnsembl Gene IDを対応づけている
tmp <- cbind(names(rank_out), data, gene_length, rank_out)       #配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「順位情報」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
out_f3 <- "hoge5DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- length(rank_out)*ratio_out                             #「配列長をもつ全遺伝子数*DEGの割合」の順位までがDEGであるという情報をparam3に格納
lenrank <- cbind(gene_length, rank_out)                          #gene_lengthとrank_outの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenrankに格納。
lenrank_s <- lenrank[order(lenrank[,1]),]                        #lenrankを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenrank_sに格納。
f <- gl(param, floor(nrow(lenrank_s)/param)+1, nrow(lenrank_s))  #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenrank_s[,2]                                               #行列len_rank_sの2列目の情報をyに格納

hoge <- rep(1, nrow(lenrank_s))                                  #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #順位情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの順位が閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

6. baySeqを用い、配列長情報があるもののみの生リードカウントデータを入力として長さ補正ありでDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge6.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えて発現データ(data)情報を取得
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(baySeq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてgene_length情報を取得
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#gene_length情報があり、かつ発現データファイル中にもあるEnsembl Gene IDのもののみ取り扱うための処理
common <- intersect(names(gene_length), rownames(data))          #二つのベクトル(names(gene_length)とrownames(data))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_data <- is.element(rownames(data), common)                   #commonで指定したEnsembl Gene IDsのrownames(data)中における位置情報をobj_dataに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
data_sub <- data[obj_data,]                                      #行列dataからobj_dataがTRUEとなっている行のみ抽出してdata_subに格納

#元々あった遺伝子数がどの程度の数になったかを表示
dim(data)                                                        #行列dataの行数と列数を表示
dim(data_sub)                                                    #行列data_subの行数と列数を表示
gene_length <- gene_length_sub                                   #gene_lengthの中身をgene_length_subにしている
data <- as.matrix(data_sub)                                      #dataの中身をmatrix形式のdata_subにしている

#baySeqを実行
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
groups <- list(NDE=rep(1, (param1+param2)), DE=data.cl)          #このデータセット中には発現変動遺伝子群(DE)とそうでないもの(NDE)が含まれているという情報をgroupsオブジェクトに格納
data1 <- new("countData", data=data, replicates=data.cl, libsizes=as.integer(colSums(data)), groups=groups, seglens=gene_length)#countDataオブジェクト形式にしてdata1に格納
data1P.NB <- getPriors.NB(data1, samplesize=5000, estimation="QL", cl=NULL)#事前パラメータの推定
out <- getLikelihoods.NB(data1P.NB, pET="BIC", cl=NULL)          #事後確率を計算
out@estProps                                                     #発現変動(DE)遺伝子がデータの中にどの程度含まれていたかを表示（右側の数値；ちなみに左側の数値はNDEの割合を示す）
stat_out <- out@posteriors[,2]                                   #事後確率(0に近いほど変動している; 0が最大値)をstat_outに格納
rank_out <- rank(-stat_out)                                      #stat_outでランキングした結果をrank_outに格納
ratio_out <- out@estProps[2]                                     #全遺伝子中に占めるDEGの割合をratio_outに格納
names(rank_out) <- rownames(data)                                #ランキング結果とEnsembl Gene IDを対応づけている
tmp <- cbind(names(rank_out), data, gene_length, rank_out)       #配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「順位情報」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
out_f3 <- "hoge6DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- length(rank_out)*ratio_out                             #「配列長をもつ全遺伝子数*DEGの割合」の順位までがDEGであるという情報をparam3に格納
lenrank <- cbind(gene_length, rank_out)                          #gene_lengthとrank_outの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenrankに格納。
lenrank_s <- lenrank[order(lenrank[,1]),]                        #lenrankを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenrank_sに格納。
f <- gl(param, floor(nrow(lenrank_s)/param)+1, nrow(lenrank_s))  #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenrank_s[,2]                                               #行列len_rank_sの2列目の情報をyに格納

hoge <- rep(1, nrow(lenrank_s))                                  #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #順位情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの順位が閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------

7. baySeqを用い、TMM正規化後の配列長情報があるもののみのデータを入力として長さ補正ありでDEGのランキングをする場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge7.txt"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えて発現データ(data)情報を取得
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(baySeq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている

#TMM正規化データの作成
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- calcNormFactors(d)                                          #TMM正規化係数を計算
norm_f <- 1000000/(colSums(data)*d$samples$norm.factors)         #TMM正規化係数はRPM正規化とセットなので、最終的に各列に対して掛ける正規化係数はnorm_fで与えられる
RPM_TMM <- sweep(data, 2, norm_f, "*")                           #TMM正規化後のデータをRPM_TMMとして格納
data <- round(RPM_TMM)                                           #以下ではRPM_TMMをdataとして取り扱うが、baySeqは整数値のみしか取り扱わないのでRPM_TMM中の小数点以下の数値を丸めた結果をdataとしている

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてgene_length情報を取得
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#gene_length情報があり、かつ発現データファイル中にもあるEnsembl Gene IDのもののみ取り扱うための処理
common <- intersect(names(gene_length), rownames(data))          #二つのベクトル(names(gene_length)とrownames(data))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_data <- is.element(rownames(data), common)                   #commonで指定したEnsembl Gene IDsのrownames(data)中における位置情報をobj_dataに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
data_sub <- data[obj_data,]                                      #行列dataからobj_dataがTRUEとなっている行のみ抽出してdata_subに格納

#元々あった遺伝子数がどの程度の数になったかを表示
dim(data)                                                        #行列dataの行数と列数を表示
dim(data_sub)                                                    #行列data_subの行数と列数を表示
gene_length <- gene_length_sub                                   #gene_lengthの中身をgene_length_subにしている
data <- as.matrix(data_sub)                                      #dataの中身をmatrix形式のdata_subにしている

#baySeqを実行
groups <- list(NDE=rep(1, (param1+param2)), DE=data.cl)          #このデータセット中には発現変動遺伝子群(DE)とそうでないもの(NDE)が含まれているという情報をgroupsオブジェクトに格納
data1 <- new("countData", data=data, replicates=data.cl, libsizes=as.integer(colSums(data)), groups=groups, seglens=gene_length)#countDataオブジェクト形式にしてdata1に格納
data1P.NB <- getPriors.NB(data1, samplesize=5000, estimation="QL", cl=NULL)#事前パラメータの推定
out <- getLikelihoods.NB(data1P.NB, pET="BIC", cl=NULL)          #事後確率を計算
out@estProps                                                     #発現変動(DE)遺伝子がデータの中にどの程度含まれていたかを表示（右側の数値；ちなみに左側の数値はNDEの割合を示す）
stat_out <- out@posteriors[,2]                                   #事後確率(0に近いほど変動している; 0が最大値)をstat_outに格納
rank_out <- rank(-stat_out)                                      #stat_outでランキングした結果をrank_outに格納
ratio_out <- out@estProps[2]                                     #全遺伝子中に占めるDEGの割合をratio_outに格納
names(rank_out) <- rownames(data)                                #ランキング結果とEnsembl Gene IDを対応づけている
tmp <- cbind(names(rank_out), data, gene_length, rank_out)       #配列長情報があるEnsembl Gene IDのみからなる入力データの右側に、「gene_length」、「順位情報」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
out_f3 <- "hoge7DE.png"                                          #出力ファイル名を指定
param3 <- length(rank_out)*ratio_out                             #「配列長をもつ全遺伝子数*DEGの割合」の順位までがDEGであるという情報をparam3に格納
lenrank <- cbind(gene_length, rank_out)                          #gene_lengthとrank_outの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenrankに格納。
lenrank_s <- lenrank[order(lenrank[,1]),]                        #lenrankを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenrank_sに格納。
f <- gl(param, floor(nrow(lenrank_s)/param)+1, nrow(lenrank_s))  #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenrank_s[,2]                                               #行列len_rank_sの2列目の情報をyに格納

hoge <- rep(1, nrow(lenrank_s))                                  #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #順位情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの順位が閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

png(out_f3, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

------    ここまで    ------






#3. RPKM正規化したデータを用いる場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f1 <- "hoge3.txt"                                            #出力ファイル名を指定
out_f2 <- "hoge3.png"                                            #出力ファイル名を指定
param1 <- 5                                                      #A群のサンプル数を指定    
param2 <- 5                                                      #B群のサンプル数を指定

#まずはEnsembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてRPM正規化
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
norm_factor1 <- 1000000/colSums(data)                            #各列に対して掛ける正規化係数を計算してnorm_factor1に格納
RPM <- sweep(data, 2, norm_factor1, "*")                         #norm_factor1を各列に掛けた結果をRPMに格納

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてgene_length情報を取得
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#RPKM正規化をするために、gene_length情報があるデータのみ抽出し、そのサブセットのみでRPKM正規化
common <- intersect(names(gene_length), rownames(RPM))           #二つのベクトル(names(gene_length)とrownames(RPM))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_RPM <- is.element(rownames(RPM), common)                     #commonで指定したEnsembl Gene IDsのrownames(RPM)中における位置情報をobj_RPMに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
RPM_sub <- RPM[obj_RPM,]                                         #行列RPMからobj_RPMがTRUEとなっている行のみ抽出してRPM_subに格納
norm_factor2 <- 1000/gene_length_sub                             #各行に対して掛ける正規化係数を計算してnorm_factor2に格納
RPKM <- sweep(RPM_sub, 1, norm_factor2, "*")                     #norm_factor2を行列RPM_subの各行に掛けた結果をRPKMに格納
data <- as.matrix(RPKM)                                          #データの型をmatrixにした結果をdataに格納

#発現変動の度合いを示すFDR値を各遺伝子について計算
data.cl <- c(rep(1, param1), rep(2, param2))                     #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- estimateCommonDisp(d)                                       #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でcommon dispersionを計算している
d <- estimateTagwiseDisp(d, prop.used=0.5, grid.length=500)      #the quantile-adjusted conditional maximum likelihood (qCML)法でmoderated tagwise dispersionを計算している
out <- exactTest(d)                                              #exact test (正確確率検定)で発現変動遺伝子を計算した結果をoutに格納
fdr <- p.adjust(out$table$PValue, method="BH")                  #False Discovery Rate (FDR)を計算し、結果をfdrに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data, gene_length_sub, fdr)         #入力データの右側に、「gene_length」、「(Benjamini and Hochbergの方法で計算した)FDR値」を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存。

lenfdr <- cbind(gene_length_sub, fdr)                            #gene_length_subとfdrの二つのベクトルを列方向で結合した結果をlenfdrに格納。
lenfdr_s <- lenfdr[order(lenfdr[,1]),]                           #lenfdrを1列目のgene_lengthでソートした結果をlenfdr_sに格納。
param <- 20                                                      #boxplotを描くときの水準数(transcript_length順でソートした結果の分割数に相当)を指定。
f <- gl(param, floor(nrow(lenfdr_s)/param)+1, nrow(lenfdr_s))    #nrow(out_s)で表される要素数からなるベクトルを20個の水準数に分割した因子オブジェクトfを作成
y <- lenfdr_s[,2]                                                #行列len_fdr_sの2列目の情報をyに格納

png(out_f2, width=600, height=300)                               #出力ファイルの各種パラメータを指定
plot(f, y, xlab="gene length", ylab="FDR")                       #横軸がgene_length, 縦軸がFDRとしてプロット
dev.off()                                                        #おまじない

#参考文献2のFigure 1dのような縦軸にしたい場合
param3 <- 0.1                                                    #FDRの閾値を指定
hoge <- rep(1, nrow(lenfdr_s))                                   #のちに水準ごとの要素数をsum関数でカウントするために1からなるベクトルを作成している
f_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとの要素数をカウントした結果をf_numに格納
hoge <- (y <= param3)                                            #FDR情報を含むyに対して、param3で指定した閾値以下のものをTRUE, それ以外をFALSEとしたベクトルを作成してhogeに格納
y_num <- tapply(hoge, f, sum)                                    #水準ごとのFDRが閾値を満たす要素数をカウントした結果をy_numに格納
ratio <- 100*y_num/f_num                                         #水準ごとのDEGとされた割合(%)を計算した結果をratioに格納

plot(levels(f), ratio, xlab="gene length", ylab="%DE")           #横軸がgene_length, 縦軸が%DEとしてプロット


------    ここまで    ------

1. RefSeqのようなmRNA配列の集合(transcriptome sequence)にマッピングし、
   
2. mRNA isoform情報(refGene)を使って「isoformのみにマップされたリード数」と「複数のisoformsに共通してマップされたリード数」をNumber of Informative Reads (NIR)としてgNIRとiNIRを計算します。（別のmRNA配列にマップされるものは使わない）
   
3. x bpのpaired-endなので実際に1.でマップした結果からpaired-endの両端の長さ(fragment size; mate pair distance)がどの程度だったか計算することができるので、 d = (x+1), (x+2), ..., 数百bp (原著論文ではx=36 bpのデータのときに250 bpとしているので、d=37, 38, ..., 250 bp)の長さの範囲で各dにおけるfragment sizeの確率P(d)を計算しておきます。
   
4. 3で考慮したdの範囲について、まずはd = x+1について考える。transcriptome sequence中の各mRNA配列(アノテーション情報が豊富なヒトなどの場合には、RefSeqとUCSC refGeneからmRNA isoform annotation情報が得られるので)について、 複数のisoformがある場合にはisoformごとにfragment sizeがdの人工的なpaired-end (Artificial paired-end; APE)を全ての可能性について(つまり、一塩基ずつずらしたものを)作成します。
   
5. 4で作成したAPE (人工的に作成したリード)をもう一度transcriptome sequenceにマップし、「isoformのみにマップされたリード数」と「複数のisoformsに共通してマップされたリード数」をカウントします。
   
6. 4-5の手順は「d = x+1について」のものでしたが、これをつぎはd= x+2、その次はd= x+3などと計算していき、3で考慮したdの範囲について計算しまくります。
   
7. そうすると、各dについての全mRNAのカウントデータが得られますので、最終的にisoformのみのほうの行列データ(iUd,i)と複数のisoformに共通した部分の行列データ(gUd,g)が得られます。
   
8. 3で得られたP(d)と7で得られた行列データをそれぞれのdについて掛けたものの和をとったものがこの論文でexpected uniquely mappable area (EUMA)と呼んでいるものです。
   例えば行列データがgUd,gのものについてのEUMA (gEUMAに相当)を計算すると、gEUMA = P(37)*gU37,g + P(38)*gU38,g + ...ということで各遺伝子gについてのEUMAが得られるわけです。(ここで、P(d)はサンプルごとに独立したものであることに注意)
   
9. というわけで、ある遺伝子gの発現量gFVKMはそのサンプルに対してマップされたトータルのリード数Nを考慮して、gFVKM = gNIR/(gEUMA*N)として計算されます。各isoformについても同様に計算されます。注意点としては、EUMAの単位はkbとなっていることと、Nの単位もmillionとなっていることです。
   

1. EDASeqパッケージ中の記述と似たやり方で示した場合：
------    ここから    ------
param_A <- 2                                                     #A群のサンプル数を指定
param_B <- 2                                                     #B群のサンプル数を指定
param1 <- "full"                                                 #正規化法(full quantile正規化の場合は"full"のまま)を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(yeastRNASeq)                                             #パッケージの読み込み
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#count dataやGC含量情報(SGD ver. r64)の読み込みとラベル情報の作成
data(geneLevelData)                                              #yeastRNASeqパッケージ中で提供されているデータをロード
data(yeastGC)                                                    #EDASeqパッケージ中で提供されているyeastのGC含量情報をロード
dim(geneLevelData)                                               #行数と列数を表示
head(geneLevelData)                                              #最初の数行を表示
length(yeastGC)                                                  #要素数を表示
head(yeastGC)                                                    #最初の数個を表示
head(rownames(geneLevelData))                                    #geneLevelData行列の行名(rownames)情報の最初の数個を表示
head(names(yeastGC))                                             #yeastGCベクトルのnames属性情報の最初の数個を表示
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#カウントデータ情報(geneLevelData)とGC含量情報(yeastGC)から共通して存在するサブセットを(同じ遺伝子名の並びで)取得
common <- intersect(rownames(geneLevelData), names(yeastGC))     #二つのベクトルから積集合(intersection)を抽出した結果をcommonに格納
length(common)                                                   #共通遺伝子数(正確にはcommonベクトルの要素数)を表示
data <- as.matrix(geneLevelData[common, ])                       #6685個の共通遺伝子分のカウントデータ行列を行列形式でdataに格納
GC <- data.frame(GC = yeastGC[common])                           #6685個の共通遺伝子分のGC含量ベクトルをデータフレーム形式でGCに格納
head(rownames(data))                                             #data行列の行名(rownames)情報の最初の数個を表示
head(rownames(GC))                                               #GC行列の行名(rownames)情報の最初の数個を表示
es <- newSeqExpressionSet(exprs = data,                          #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   featureData = GC,                             #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示

#横軸：GC含量、縦軸：log(count)のプロットを作成しbiasの有無をチェック
#（GC含量依存性があることがわかる。ちなみにbiasがない場合には水平線になる）
biasPlot(es, "GC", log = T, ylim = c(-1, 4))                     #プロット。A群("mut_1" and "mut_2"に相当)のラベルが1, B群("wt_1" and "wt_2"に相当)のラベルが2としてプロットされている。

#本番(full quantile(FQ)正規化)
out <- withinLaneNormalization(es, "GC", which = param1)         #サンプル（列 or レーン）ごとに正規化を実行した結果をoutに格納

#横軸：GC含量、縦軸：log(count)のプロットを作成し正規化後の状態をチェック
#（GC含量依存性が緩和されていることがわかる。full quantileなのになぜ水平にならないんだろう。。。）
biasPlot(out, "GC", log = T, ylim = c(-1, 4))                    #プロット。A群("mut_1" and "mut_2"に相当)のラベルが1, B群("wt_1" and "wt_2"に相当)のラベルが2としてプロットされている。

#GC bias補正前後のカウントデータとGC含量の情報をファイルに出力したい場合
out_f1 <- "data_yeastGCbias_common_before.txt"                   #出力ファイル名1(補正前のカウントデータ)を指定
out_f2 <- "data_yeastGCbias_common_after.txt"                    #出力ファイル名2(補正後のカウントデータ)を指定
out_f3 <- "data_yeastGCbias_common_GCcontent.txt"                #出力ファイル名3(GC含量のデータ)を指定
tmp <- cbind(rownames(exprs(es)), exprs(es))                     #補正前のカウント情報exprs(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存
tmp <- cbind(rownames(exprs(out)), exprs(out))                   #補正前のカウント情報exprs(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f2で指定したファイル名で保存
tmp <- cbind(rownames(fData(es)), fData(es))                     #GC含量情報fData(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f3, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f3で指定したファイル名で保存

#GC bias補正前後のoffset(logスケールでの補正前後の差、正規化係数のlog、に相当)ファイルに出力したい場合
out_f4 <- "data_yeastGCbias_common_offset.txt"                   #出力ファイル名4(offset情報)を指定
out2 <- withinLaneNormalization(es, "GC", which = param1, offset = TRUE)#サンプル（列 or レーン）ごとに正規化を実行した結果をoutに格納
head(offst(out2))                                                #offset値(i.e., 正規化係数のlog)の最初の数行を表示
tmp <- cbind(rownames(offst(out2)), offst(out2))                 #offset情報offst(out2)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f4, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f4で指定したファイル名で保存

#offsetと正規化前後の数値の関係を簡単に説明
head(exprs(out))                                                 #a. 正規化後のカウントデータの最初の数行を表示
head(exprs(es))                                                  #b. 正規化前のカウントデータの最初の数行を表示
head(exp(offst(out2)))                                           #c. (logスケールのなので)オリジナルスケール上でのoffset値にした状態で最初の数行を表示
normalized <- exprs(es) * exp(offst(out2))                       #d. 「正規化前のカウントデータ」に「オリジナルスケールのoffset値」を掛けた結果をnormalizedに格納
head(normalized)                                                 #e. 掛け算(b * c)で得た正規化後のカウントデータnormalizedの最初の数行を表示(a.と微妙に異なっていることがわかる)
head(round(normalized))                                          #f. 「a.の正規化後のデータ」は、e.のnormalizedの実数の数値をround関数で最も近い整数値に丸めたものです。

------    ここまで    ------

2. 二つのタブ区切りテキストファイルの読み込みからやる場合：
7,065行×4列のyeast RNA-seqデータ(data_yeast_7065.txt; 2 wild-types vs. 2 mutant strains; technical replicates)
6,717 yeast genes (SGD ver. r64)のGC含量(yeastGC_6717.txt)
------    ここから    ------
in_f1 <- "data_yeast_7065.txt"                                   #入力ファイル名(タグカウントファイル)を指定
in_f2 <- "yeastGC_6717.txt"                                      #入力ファイル名(GC含量情報を含むファイル)を指定
param_A <- 2                                                     #A群のサンプル数を指定
param_B <- 2                                                     #B群のサンプル数を指定
param1 <- "full"                                                 #正規化法(full quantile正規化の場合は"full"のまま)を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#count dataやGC含量情報の読み込みとラベル情報の作成
data.tmp <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#in_f1で指定したファイルを読み込んでdata.tmpに格納
gc.tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#in_f2で指定したファイルを読み込んでgc.tmpに格納
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#カウントデータ情報(data.tmp)とGC含量情報(gc.tmp)から共通して存在するサブセットを(同じ遺伝子名の並びで)取得
common <- intersect(rownames(data.tmp), rownames(gc.tmp))        #二つのベクトルから積集合(intersection)を抽出した結果をcommonに格納
length(common)                                                   #共通遺伝子数(正確にはcommonベクトルの要素数)を表示
data <- as.matrix(data.tmp[common, ])                            #6685個の共通遺伝子分のカウントデータ行列を行列形式でdataに格納
GC <- data.frame(GC = gc.tmp[common, ])                          #6685個の共通遺伝子分のGC含量行列を行列形式でGCに格納
rownames(GC) <- common                                           #行列GCにrownamesを代入している（消えてしまっているためです）
es <- newSeqExpressionSet(exprs = data,                          #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   featureData = GC,                             #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示

#横軸：GC含量、縦軸：log(count)のプロットを作成しbiasの有無をチェック
#（GC含量依存性があることがわかる。ちなみにbiasがない場合には水平線になる）
biasPlot(es, "GC", log = T, ylim = c(-1, 4))                     #プロット。A群("mut_1" and "mut_2"に相当)のラベルが1, B群("wt_1" and "wt_2"に相当)のラベルが2としてプロットされている。

#本番(full quantile(FQ)正規化)
out <- withinLaneNormalization(es, "GC", which = param1)         #サンプル（列 or レーン）ごとに正規化を実行した結果をoutに格納

#横軸：GC含量、縦軸：log(count)のプロットを作成し正規化後の状態をチェック
#（GC含量依存性が緩和されていることがわかる。full quantileなのになぜ水平にならないんだろう。。。）
biasPlot(out, "GC", log = T, ylim = c(-1, 4))                    #プロット。A群("mut_1" and "mut_2"に相当)のラベルが1, B群("wt_1" and "wt_2"に相当)のラベルが2としてプロットされている。

#GC bias補正前後のカウントデータとGC含量の情報をファイルに出力したい場合
out_f1 <- "data_yeastGCbias_common_before.txt"                   #出力ファイル名1(補正前のカウントデータ)を指定
out_f2 <- "data_yeastGCbias_common_after.txt"                    #出力ファイル名2(補正後のカウントデータ)を指定
out_f3 <- "data_yeastGCbias_common_GCcontent.txt"                #出力ファイル名3(GC含量のデータ)を指定
tmp <- cbind(rownames(exprs(es)), exprs(es))                     #補正前のカウント情報exprs(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f1, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f1で指定したファイル名で保存
tmp <- cbind(rownames(exprs(out)), exprs(out))                   #補正前のカウント情報exprs(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f2, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f2で指定したファイル名で保存
tmp <- cbind(rownames(fData(es)), fData(es))                     #GC含量情報fData(es)の左側にその行名（つまり遺伝子名）を結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f3, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_f3で指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

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1. サンプルデータ14の10,000 genes×2 samplesの「複製なし」タグカウントデータ(data_hypodata_1vs1.txt)
シミュレーションデータ(G1群1サンプル vs. G2群1サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_1vs1.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_1vs1_DEGESTbT.txt"                    #出力ファイル名を指定
param_A <- 1                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 1                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param1 <- 1                                                      #TMM-(baySeq-TMM)nパイプラインのnの値(iterationの回数)を指定(デフォルトは1)
param2 <- 10000                                                  #ブートストラップリサンプリング回数(10000が推奨。すごく時間がかかります。とりあえず、という人は500とかでやってみてください。)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#iDEGES/DESeq正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method = "tmm", test.method = "bayseq",#正規化を実行した結果をtccに格納
                    iteration=param1, samplesize=param2)         #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.19941 18.87876)

#iDEGES/DESeq正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が8,049個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が936個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が1015個と判定されていたことがわかる。

#iDEGES/DESeq正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7786209 1.2213791)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.134), G1で高発現のDEG(青; -1.866), G2で高発現のDEG(赤; 2.187)

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1. サンプルデータ14の10,000 genes×2 samplesの「複製なし」タグカウントデータ(data_hypodata_1vs1.txt)
シミュレーションデータ(G1群1サンプル vs. G2群1サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_1vs1.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_1vs1_iDEGESDESeq.txt"                    #出力ファイル名を指定
param_A <- 1                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 1                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param1 <- 3                                                      #DESeq-(DESeq-DESeq)nパイプラインのnの値(iterationの回数)を指定(デフォルトは3)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#iDEGES/DESeq正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, iteration=param1)                    #正規化を実行した結果をtccに格納(iDEGES/edgeRのときと同じコマンドだが、内部的にカウント行列の列数で自動判定してiDEGES/DESeqを採用している)

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.33728 18.71540)

#iDEGES/DESeq正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が9,500個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が500個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が0個と判定されていたことがわかるが、これはバグで実際にはG2で高発現のものもある。

#iDEGES/DESeq正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7707068 1.2292932)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.110), G1で高発現のDEG(青; -1.890), G2で高発現のDEG(赤; 2.163)

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ14の10,000 genes×2 samplesの「複製なし」タグカウントデータ(data_hypodata_1vs1.txt)
シミュレーションデータ(G1群1サンプル vs. G2群1サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_1vs1.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_1vs1_TMM.txt"                            #出力ファイル名を指定
param_A <- 1                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 1                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TMM正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm", iteration=0)      #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.04961 19.06260)

#TMM正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7874063 1.2125937)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.161), G1で高発現のDEG(青; -1.839), G2で高発現のDEG(赤; 2.213)

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_iDEGESedgeR.txt"                    #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param1 <- 3                                                      #TMM-(edgeR-TMM)nパイプラインのnの値(iterationの回数)を指定(デフォルトは3)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#iDEGES/edgeR正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, iteration=param1)                    #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.73976 17.92443 17.74807 18.17837 17.23521 17.16515)

#iDEGES/edgeR正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が8,679個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,109個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が212個と判定されていたことがわかる

#iDEGES/edgeR正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7469719 0.8344937 0.7237473 1.2551083 1.1897781 1.2499007)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.033), G1で高発現のDEG(青; -1.960), G2で高発現のDEG(赤; 2.043)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_iDEGESedgeR.txt"                       #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param1 <- 3                                                      #TMM-(edgeR-TMM)nパイプラインのnの値(iterationの回数)を指定(デフォルトは3)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#iDEGES/edgeR正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, iteration=param1)                    #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#iDEGES/edgeR正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が4,036個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,284個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が1,745個と判定されていたことがわかる。実に100*(1284+1745)/7065=42.873%がDEGと判定されていることになるがtechnical replicatesのデータなので妥当といえば妥当。

#iDEGES/edgeR正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1860633 1.1823388 0.8178319 0.8137659)

------    ここまで    ------

3. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
このデータはどのサンプルでも発現していない（zero count; ゼロカウント）ものが多いので、
どこかのサンプルで0より大きいカウントのもののみからなるサブセットを抽出して2.と同様の計算を行っています。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_iDEGESedgeR2.txt"                      #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param1 <- 3                                                      #TMM-(edgeR-TMM)nパイプラインのnの値(iterationの回数)を指定(デフォルトは3)
param_lowcount <- 0                                              #低発現遺伝子のフィルタリングを行う際の閾値。遺伝子(行)ごとにカウントの総和を計算し、ここで指定した値よりも大きいものだけがその後の解析に用いられる

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成
dim(tcc$count)                                                   #カウント行列の行数と列数を表示(7065行4列)

#フィルタリングの実行（低発現のものを除去）
tcc <- filterLowCountGenes(tcc, low.count = param_lowcount)      #param_lowcountで指定した閾値より大きい総カウント数をもつ遺伝子のみを抽出している
dim(tcc$count)                                                   #カウント行列の行数と列数を表示(6508行4列になっていることがわかる)

#iDEGES/edgeR正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, iteration=param1)                    #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#iDEGES/edgeR正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が3,447個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,311個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が1,750個と判定されていたことがわかる

#iDEGES/edgeR正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1849185 1.1802298 0.8192871 0.8155645)

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_TbT.txt"                            #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param_samplesize <- 10000                                        #TbT法のstep2中で行うブートストラップリサンプリング回数(10000が推奨。すごく時間がかかります。とりあえず、という人は500とか1000とかでやってみてください。)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TbT正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm",                   #正規化を実行した結果をtccに格納
               test.method="bayseq", samplesize=param_samplesize)#正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.70699, 17.78708, 17.60127, 18.20635, 17.41963, 17.27200)

#TbT正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が8,494個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,134個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が372個と判定されていたことがわかる

#TbT正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7494026 0.8421160 0.7308061 1.2549357 1.1788312 1.2439084)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.049), G1で高発現のDEG(青; -1.942), G2で高発現のDEG(赤; 2.061)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_TbT.txt"                               #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param_samplesize <- 10000                                        #TbT法のstep2中で行うブートストラップリサンプリング回数(10000が推奨。すごく時間がかかります。とりあえず、という人は500とか1000とかでやってみてください。)

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TbT正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm",                   #正規化を実行した結果をtccに格納
               test.method="bayseq", samplesize=param_samplesize)#正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#TbT正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が3,927個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,604個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が1,534個と判定されていたことがわかる。実に100*(1604+1534)/7065=44.416%がDEGと判定されていることになるがtechnical replicatesのデータなので妥当といえば妥当。

#TbT正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1456801 1.1463897 0.8556477 0.8522824)

------    ここまで    ------

3. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
このデータはどのサンプルでも発現していない（zero count; ゼロカウント）ものが多いので、
どこかのサンプルで0より大きいカウントのもののみからなるサブセットを抽出して2.と同様の計算を行っています。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_TbT2.txt"                              #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param_samplesize <- 10000                                        #TbT法のstep2中で行うブートストラップリサンプリング回数(10000が推奨。すごく時間がかかります。とりあえず、という人は500とか1000とかでやってみてください。)
param_lowcount <- 0                                              #低発現遺伝子のフィルタリングを行う際の閾値。遺伝子(行)ごとにカウントの総和を計算し、ここで指定した値よりも大きいものだけがその後の解析に用いられる

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成
dim(tcc$count)                                                   #カウント行列の行数と列数を表示(7065行4列)

#フィルタリングの実行（低発現のものを除去）
tcc <- filterLowCountGenes(tcc, low.count = param_lowcount)      #param_lowcountで指定した閾値より大きい総カウント数をもつ遺伝子のみを抽出している
dim(tcc$count)                                                   #カウント行列の行数と列数を表示(6508行4列になっていることがわかる)

#TbT正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm",                   #正規化を実行した結果をtccに格納
               test.method="bayseq", samplesize=param_samplesize)#正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#TbT正規化のstep2で検出されたpotential DEGの結果(step3で使われないものたち)を表示
table(tcc$private$DEGES.potentialDEG)                            #0 (nonDEGに相当)が3,285個、1 (G1で高発現のDEGに相当)が1,656個、2 (G2で高発現のDEGに相当)が1,567個と判定されていたことがわかる

#TbT正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1448574 1.1433478 0.8578253 0.8539695)

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_TMM.txt"                            #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TMM正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm", iteration=0)      #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.06540 17.15646 17.07707 18.90293 18.04854 17.93468)

#TMM正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7843388 0.8806613 0.7597886 1.2192004 1.1476476 1.2083632)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.152), G1で高発現のDEG(青; -1.840), G2で高発現のDEG(赤; 2.164)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_TMM.txt"                               #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TMM正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm", iteration=0)      #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#TMM正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1391738 1.1395812 0.8596891 0.8615559)

------    ここまで    ------

3. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
TCCを使わずにedgeRパッケージ内の関数を用いて2.と同じ結果を出すやり方です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_TMM2.txt"                              #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#TMM正規化本番
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- calcNormFactors(d)                                          #正規化係数を計算
d$samples$norm.factors                                           #edgeRパッケージから得られる正規化係数そのものを表示(1.1504029 1.1508142 0.8681632 0.8700484)
mean(d$samples$norm.factors)                                     #正規化係数の平均が1でないことがわかる(1.009857)
norm.factors <- d$samples$norm.factors/mean(d$samples$norm.factors)#正規化係数の平均が1になるように正規化したものがTCCパッケージで得られるものと同じです
norm.factors                                                     #TCCパッケージから得られるTMM正規化係数と同じになっていることがわかる(1.1391738 1.1395812 0.8596891 0.8615559)

#正規化後のデータをファイルに出力
ef.libsizes <- colSums(data)*norm.factors                        #effective library sizesというのはlibrary sizesに正規化係数を掛けたものなのでそれを計算した結果をef.libsizesに格納
normalized.count <- sweep(data, 2, mean(ef.libsizes)/ef.libsizes, "*")#正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

4. サンプルデータ14の10,000 genes×2 samplesの「複製なし」タグカウントデータ(data_hypodata_1vs1.txt)
シミュレーションデータ(G1群1サンプル vs. G2群1サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_1vs1.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_1vs1_TMM.txt"                            #出力ファイル名を指定
param_A <- 1                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 1                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#TMM正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="tmm", iteration=0)      #正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(17.04961 19.06260)

#TMM正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7874063 1.2125937)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.161), G1で高発現のDEG(青; -1.839), G2で高発現のDEG(赤; 2.213)

------    ここまで    ------

5. サンプルデータ2の32,000 genes×10 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(SupplementaryTable2_changed.txt)
technical replicatesのデータ(Kidney群5サンプル vs. Liver群5サンプル)です。
ごく昔の記述です。参考まで。
------    ここから    ------
in_f <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                        #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed_TMM2.txt"                  #出力ファイル名を指定
param_A <- 5                                                     #A群のサンプル数を指定    
param_B <- 5                                                     #B群のサンプル数を指定
param3 <- 1000000                                                #補正後の総リード数を指定(RPMデータと同程度の数値分布にしたい場合はここは変更しないで)

#必要なパッケージなどをロード
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#TMM正規化本番
d <- DGEList(counts=data, group=data.cl)                         #DGEListオブジェクトを作成してdに格納
d <- calcNormFactors(d)                                          #TMM正規化係数を計算
norm_f_TMM <- d$samples$norm.factors                             #TMM正規化係数の情報を抽出してnorm_f_TMMに格納
names(norm_f_TMM) <- colnames(data)                              #norm_f_TMMのnames属性をcolnames(data)で与えている
effective_libsizes <- colSums(data) * norm_f_TMM                 #effective library sizesというのはlibrary sizesに(TMM)正規化係数を掛けたものなのでそれを計算した結果をeffective_libsizesに格納
RPM_TMM <- sweep(data, 2, param3/effective_libsizes, "*")        #元のカウントデータをeffective_libsizesで割り（RPMデータと同程度の数値分布にしたいので）param3を掛けた正規化後のデータをRPM_TMMに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
data <- RPM_TMM                                                  #RPM_TMMをdataに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#おまけとして、TMM正規化後のデータでM-A plotを描画
data <- RPM_TMM                                                  #RPM_TMMをdataに格納
meanA <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==1]), 1, mean))      #遺伝子ごとにA群の平均の対数を計算した結果をmeanAに格納
meanB <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==2]), 1, mean))      #遺伝子ごとにB群の平均の対数を計算した結果をmeanBに格納
x_axis <- (meanA + meanB)/2                                      #「A群の平均値」と「B群の平均値」の平均をとったものがM-A plotのA(x軸の値)に相当するものなのでx_axisに格納)
y_axis <- meanB - meanA                                          #いわゆるlog比(logの世界での引き算)がM-A plotのM(y軸の値)に相当するものなのでy_axisに格納)
plot(x_axis, y_axis, xlab="A = (log2(B)+log2(A))/2", ylab="M = log2(B)-log2(A)", pch=20, cex=.1)#MA-plotを描画
grid(col="gray", lty="dotted")                                   #指定したパラメータでグリッドを表示

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_AH.txt"                             #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#Anders and Huberの(AH)正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="deseq", iteration=FALSE)#正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(16.83471 17.03814 16.87943 19.26712 18.12903 18.16272)

#正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(0.7974195 0.8893788 0.7709404 1.1996644 1.1459043 1.1966927)

#このデータは「答え」がわかっているものなので、答え(DEG or non-DEG)の情報込みで正規化後のデータのM-A plotを描画
tcc$private$simulation <- TRUE                                   #おまじない
tcc$simulation$trueDEG <- c(rep(1, 1800), rep(2, 200), rep(0, 8000))#真の情報からなるベクトルをtccクラスオブジェクトに格納
plot(tcc, median.lines=TRUE)                                     #log-ratio(縦軸の値)のmedian値をそれぞれの色で表示：non-DEG(黒; 0.186), G1で高発現のDEG(青; -1.809), G2で高発現のDEG(赤; 2.196)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_AH.txt"                                #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(TCC)                                                     #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとTCCクラスオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
tcc <- new("TCC", as.matrix(data), c(param_A, param_B))          #TCCクラスオブジェクトtccを作成

#Anders and Huberの(AH)正規化の実行
tcc <- calcNormFactors(tcc, norm.method="deseq", iteration=FALSE)#正規化を実行した結果をtccに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- getNormalizedData(tcc)                       #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでM-A plotを描画
plot(tcc)                                                        #M-A plotを描画

#正規化係数を表示
tcc$norm.factors                                                 #正規化係数を表示(1.1431946 1.1408795 0.8568723 0.8590536)

#正規化後のデータの列ごとの各種要約統計量を表示
summary(normalized.count)                                        #normalized.countの各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示

------    ここまで    ------

3. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
TCCを使わずにDESeqパッケージ内の関数を用いて2.と同じ結果を出すやり方です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_AH2.txt"                               #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(DESeq)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#Anders and Huberの(AH)正規化本番
cds <- newCountDataSet(data, data.cl)                            #CountDataSetオブジェクトを作成してcdsに格納
cds <- estimateSizeFactors(cds)                                  #size factorを計算し、結果をcdsに格納
sizeFactors(cds)                                                 #これがDESeqのsize factorsです(1.1365363 1.1272941 0.8835836 0.9287529)
norm.factors <- sizeFactors(cds)/colSums(data)                   #DESeqのsize factorsから「DESeqの正規化係数(これの平均が1になるとは限らない)」をnorm.factorsに格納
norm.factors <- norm.factors/mean(norm.factors)                  #正規化係数の平均が1になるように正規化した「これ(norm.factors)」がTCCパッケージで得られる「DESeqの正規化係数」です
norm.factors                                                     #norm.factorsの中身を表示(1.1431946 1.1408795 0.8568723 0.8590536)。TCCパッケージから得られる「DESeqの正規化係数」と同じになっていることがわかる。

#正規化後のデータをファイルに出力
sizeFactors(cds) <- sizeFactors(cds)/mean(sizeFactors(cds))      #正規化後のデータ取得自体は「DESeqの正規化係数」とは無関係に取得可能であるが、TCC経由で得られるものと同じにするためにsize factorsの平均が1になるように正規化している
normalized.count <- counts(cds, normalized=TRUE)                 #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータの列ごとの各種要約統計量を表示
summary(normalized.count)                                        #normalized.countの各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示

------    ここまで    ------

4. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
DESeqパッケージ内の関数を用いてDESeqパッケージ内のマニュアル通りにやった場合。
若干数値が違ってきます（ということを示したいだけです）が正規化後の値の要約統計量をどこに揃えるか程度の違いなので気にする必要はないです。
実際、ここで得られるsize factorsの平均は1.019042ですが、この定数値を正規化後のデータに掛けるとTCCで得られるデータと同じになります。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_AH3.txt"                               #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(DESeq)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#Anders and Huberの(AH)正規化本番
cds <- newCountDataSet(data, data.cl)                            #CountDataSetオブジェクトを作成してcdsに格納
cds <- estimateSizeFactors(cds)                                  #size factorを計算し、結果をcdsに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- counts(cds, normalized=TRUE)                 #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータの列ごとの各種要約統計量を表示
summary(normalized.count)                                        #normalized.countの各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示

------    ここまで    ------

5. SupplementaryTable2_changed.txtの「5 samples vs. 5 samples」の比較の場合：
昔の記述です。参考まで。
------    ここから    ------
in_f <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                        #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed_DESeq.txt"                 #出力ファイル名を指定
param_A <- 5                                                     #A群のサンプル数を指定    
param_B <- 5                                                     #B群のサンプル数を指定
param3 <- 1000000                                                #補正後の総リード数を指定(RPMデータと同程度の数値分布にしたい場合はここは変更しないで)

#必要なパッケージなどをロード
library(DESeq)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#DESeq正規化本番
cds <- newCountDataSet(data, data.cl)                            #おまじない（CountDataSetというクラスを作成している）
cds <- estimateSizeFactors(cds)                                  #おまじない（サンプル間でマップされたread数が異なるのを補正するための正規化係数を計算している;いわゆるRPMの計算をしているような認識で差し支えない）
#data_DESeq <- sweep(data, 2, 1/sizeFactors(cds), "*")           #生のリードカウントデータをDESeq正規化係数を含む補正後のライブラリサイズで割った正規化後のデータをdata_DESeqに格納
sizeFactors(cds)                                                 #計算された補正後のライブラリサイズを表示しているだけ
norm_f_DESeq <- sizeFactors(cds) * mean(colSums(data)) / colSums(data)#DESeq正規化係数の情報を抽出してnorm_f_DESeqに格納
effective_libsizes <- colSums(data) * norm_f_DESeq               #effective library sizesというのはlibrary sizesに正規化係数を掛けたものなのでそれを計算した結果をeffective_libsizesに格納
data_DESeq <- sweep(data, 2, mean(colSums(data))/effective_libsizes, "*")#生のリードカウントデータをDESeq正規化係数を含む補正後のライブラリサイズで割った正規化後のデータをdata_DESeqに格納
colSums(counts(cds, normalized=TRUE))                            #正規化後のデータについて、列ごとのSumを表示
colSums(data_DESeq)                                              #正規化後のデータについて、列ごとのSumを表示(上の結果と同じなので正しい正規化後のデータを得られていることが分かる)

#正規化後のデータをファイルに出力
data <- data_DESeq                                               #data_DESeqをdataに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#おまけとして、DESeq正規化後のデータでM-A plotを描画
data <- data_DESeq                                               #data_DESeqをdataに格納
meanA <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==1]), 1, mean))      #遺伝子ごとにA群の平均の対数を計算した結果をmeanAに格納
meanB <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==2]), 1, mean))      #遺伝子ごとにB群の平均の対数を計算した結果をmeanBに格納
x_axis <- (meanA + meanB)/2                                      #「A群の平均値」と「B群の平均値」の平均をとったものがM-A plotのA(x軸の値)に相当するものなのでx_axisに格納)
y_axis <- meanB - meanA                                          #いわゆるlog比(logの世界での引き算)がM-A plotのM(y軸の値)に相当するものなのでy_axisに格納)
plot(x_axis, y_axis, xlab="A = (log2(B)+log2(A))/2", ylab="M = log2(B)-log2(A)", pch=20, cex=.1)#MA-plotを描画
grid(col="gray", lty="dotted")                                   #指定したパラメータでグリッドを表示

------    ここまで    ------

6. SupplementaryTable2_changed2.txtの「1 sample vs. 1 sample」の比較の場合：
昔の記述です。参考まで。
------    ここから    ------
in_f <- "SupplementaryTable2_changed2.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed2_DESeq.txt"                #出力ファイル名を指定
param_A <- 1                                                     #A群のサンプル数を指定    
param_B <- 1                                                     #B群のサンプル数を指定
param3 <- 1000000                                                #補正後の総リード数を指定(RPMデータと同程度の数値分布にしたい場合はここは変更しないで)

#必要なパッケージなどをロード
library(DESeq)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとラベル情報の作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- as.matrix(data)                                          #データの型をmatrixにしている
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

#DESeq正規化本番
cds <- newCountDataSet(data, data.cl)                            #おまじない（CountDataSetというクラスを作成している）
cds <- estimateSizeFactors(cds)                                  #おまじない（サンプル間でマップされたread数が異なるのを補正するための正規化係数を計算している;いわゆるRPMの計算をしているような認識で差し支えない）
#data_DESeq <- sweep(data, 2, 1/sizeFactors(cds), "*")           #生のリードカウントデータをDESeq正規化係数を含む補正後のライブラリサイズで割った正規化後のデータをdata_DESeqに格納
sizeFactors(cds)                                                 #計算された補正後のライブラリサイズを表示しているだけ
norm_f_DESeq <- sizeFactors(cds) * mean(colSums(data)) / colSums(data)#DESeq正規化係数の情報を抽出してnorm_f_DESeqに格納
effective_libsizes <- colSums(data) * norm_f_DESeq               #effective library sizesというのはlibrary sizesに正規化係数を掛けたものなのでそれを計算した結果をeffective_libsizesに格納
data_DESeq <- sweep(data, 2, mean(colSums(data))/effective_libsizes, "*")#生のリードカウントデータをDESeq正規化係数を含む補正後のライブラリサイズで割った正規化後のデータをdata_DESeqに格納
colSums(counts(cds, normalized=TRUE))                            #正規化後のデータについて、列ごとのSumを表示
colSums(data_DESeq)                                              #正規化後のデータについて、列ごとのSumを表示(上の結果と同じなので正しい正規化後のデータを得られていることが分かる)

#正規化後のデータをファイルに出力
data <- data_DESeq                                               #data_DESeqをdataに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#おまけとして、DESeq正規化後のデータでM-A plotを描画
data <- data_DESeq                                               #data_DESeqをdataに格納
meanA <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==1]), 1, mean))      #遺伝子ごとにA群の平均の対数を計算した結果をmeanAに格納
meanB <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==2]), 1, mean))      #遺伝子ごとにB群の平均の対数を計算した結果をmeanBに格納
x_axis <- (meanA + meanB)/2                                      #「A群の平均値」と「B群の平均値」の平均をとったものがM-A plotのA(x軸の値)に相当するものなのでx_axisに格納)
y_axis <- meanB - meanA                                          #いわゆるlog比(logの世界での引き算)がM-A plotのM(y軸の値)に相当するものなのでy_axisに格納)
plot(x_axis, y_axis, xlab="A = (log2(B)+log2(A))/2", ylab="M = log2(B)-log2(A)", pch=20, cex=.1)#MA-plotを描画
grid(col="gray", lty="dotted")                                   #指定したパラメータでグリッドを表示

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_UQ.txt"                             #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param1 <- "upper"                                                #upper-quartile正規化法("upper")を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとSeqExpressionSetオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

es <- newSeqExpressionSet(exprs = as.matrix(data),               #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示
summary(exprs(es))                                               #発現データの要約統計量を表示(UQ値が揃っていないことがわかる; 3rd Qu.のところ)

#UQ正規化の実行
hoge <- betweenLaneNormalization(es, which=param1)               #正規化を実行した結果をhogeに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- exprs(hoge)                                  #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
summary(normalized.count)                                        #正規化後のデータの要約統計量を表示(UQ値が75に揃っていることがわかる; 3rd Qu.のところ)
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(16      16      16      20      19      19)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_UQ.txt"                                #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param1 <- "upper"                                                #upper-quartile正規化法("upper")を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとSeqExpressionSetオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

es <- newSeqExpressionSet(exprs = as.matrix(data),               #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示
summary(exprs(es))                                               #発現データの要約統計量を表示(UQ値が揃っていないことがわかる; 3rd Qu.のところ; 51, 51, 42, 44)

#UQ正規化の実行
hoge <- betweenLaneNormalization(es, which=param1)               #正規化を実行した結果をhogeに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- exprs(hoge)                                  #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
summary(normalized.count)                                        #正規化後のデータの要約統計量を表示(UQ値が47に揃っていることがわかる; 3rd Qu.のところ)
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

1. サンプルデータ13の10,000 genes×6 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_hypodata_3vs3.txt)
Biological replicatesを模倣したシミュレーションデータ(G1群3サンプル vs. G2群3サンプル)です。
gene_1〜gene_2000までがDEG (最初の1800個がG1群で高発現、残りの200個がG2群で高発現)
gene_2001〜gene_10000までがnon-DEGであることが既知です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_hypodata_3vs3.txt"                                 #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_hypodata_3vs3_Qu.txt"                             #出力ファイル名を指定
param_A <- 3                                                     #A群(G1群)のサンプル数を指定    
param_B <- 3                                                     #B群(G2群)のサンプル数を指定
param1 <- "full"                                                 #Quantile正規化法("full")を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとSeqExpressionSetオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

es <- newSeqExpressionSet(exprs = as.matrix(data),               #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示
summary(exprs(es))                                               #発現データの要約統計量を表示(分布が揃っていないことがわかる)

#UQ正規化の実行
hoge <- betweenLaneNormalization(es, which=param1)               #正規化を実行した結果をhogeに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- exprs(hoge)                                  #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
summary(normalized.count)                                        #正規化後のデータの要約統計量を表示(分布が完全に揃っていることがわかる)
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存


#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみを用いて(logスケールで)boxplot
nonDEG <- 2001:10000                                             #non-DEGの位置情報をnonDEGに格納
boxplot(log(normalized.count[nonDEG, ]))                         #boxplot (non-DEGなので分布が揃っているほどよい正規化法であることを意味する。一部0のlogをとろうとしているので警告が出る、、、が気にしない)

#正規化後のデータでnon-DEGsに相当する2001-10000行目のデータのみについて要約統計量を表示（サンプル間の数値が揃っているほどよい）
summary(normalized.count[nonDEG, ])                              #各列(つまりサンプル)の要約統計量を表示
apply(normalized.count[nonDEG, ], 2, median)                     #各列(つまりサンプル)のmedian(中央値)を表示(16      16      16      20      19      19)

------    ここまで    ------

2. サンプルデータ10の7,065 genes×4 samplesの「複製あり」タグカウントデータ(data_yeast_7065.txt)
technical replicatesのデータ(mut群2サンプル vs. wt群2サンプル)です。
------    ここから    ------
in_f <- "data_yeast_7065.txt"                                    #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "data_yeast_7065_Qu.txt"                                #出力ファイル名を指定
param_A <- 2                                                     #A群(mut群)のサンプル数を指定    
param_B <- 2                                                     #B群(wt群)のサンプル数を指定
param1 <- "full"                                                 #Quantile正規化法("full")を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(EDASeq)                                                  #パッケージの読み込み

#発現データの読み込みとSeqExpressionSetオブジェクトの作成
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成

es <- newSeqExpressionSet(exprs = as.matrix(data),               #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                   phenoData = data.frame(conditions = data.cl,  #SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
                                     row.names = colnames(data)))#SeqExpressionSetというクラスにデータを格納
es                                                               #esを表示
summary(exprs(es))                                               #発現データの要約統計量を表示(分布が揃っていないことがわかる)

#UQ正規化の実行
hoge <- betweenLaneNormalization(es, which=param1)               #正規化を実行した結果をhogeに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
normalized.count <- exprs(hoge)                                  #正規化後のデータを取り出してnormalized.countに格納
summary(normalized.count)                                        #正規化後のデータの要約統計量を表示(分布が完全に揃っていることがわかる)
tmp <- cbind(rownames(normalized.count), normalized.count)       #「rownames情報」と「正規化後のデータ」を列方向で結合した結果をtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存

------    ここまで    ------

1.昔ながら？！のやり方の場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                        #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed_RPM.txt"                   #出力ファイル名を指定
param1 <- 1000000                                                #補正後の総リード数を指定(RPMにしたい場合はここの数値はそのまま)

data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み

#RPM正規化
norm_f_RPM <- param1/colSums(data)                               #各列に対して掛ける正規化係数を計算してnorm_f_RPMに格納
RPM <- sweep(data, 2, norm_f_RPM, "*")                           #norm_f_RPMを各列に掛けた結果をRPMに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
data <- RPM                                                      #RPMをdataに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#おまけとして、RPM正規化後のデータでM-A plotを描画
param_A <- 5                                                     #A群のサンプル数を指定    
param_B <- 5                                                     #B群のサンプル数を指定
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
data <- RPM                                                      #RPMをdataに格納
meanA <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==1]), 1, mean))      #遺伝子ごとにA群の平均の対数を計算した結果をmeanAに格納
meanB <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==2]), 1, mean))      #遺伝子ごとにB群の平均の対数を計算した結果をmeanBに格納
x_axis <- (meanA + meanB)/2                                      #「A群の平均値」と「B群の平均値」の平均をとったものがM-A plotのA(x軸の値)に相当するものなのでx_axisに格納)
y_axis <- meanB - meanA                                          #いわゆるlog比(logの世界での引き算)がM-A plotのM(y軸の値)に相当するものなのでy_axisに格納)
plot(x_axis, y_axis, xlab="A = (log2(B)+log2(A))/2", ylab="M = log2(B)-log2(A)", pch=20, cex=.1)#MA-plotを描画
grid(col="gray", lty="dotted")                                   #指定したパラメータでグリッドを表示

------    ここまで    ------

2.edgeRパッケージ中のcpm関数を用いるやり方の場合：
------    ここから    ------
in_f <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                        #読み込みたい発現データファイルを指定してin_fに格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed_RPM.txt"                   #出力ファイル名を指定

#必要なパッケージなどをロード
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み

#発現データの読み込み
data <- read.table(in_f, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み

#CPM正規化の実行
RPM <- cpm(data)                                                 #CPM正規化を実行した結果をRPMに格納

#正規化後のデータをファイルに出力
data <- RPM                                                      #RPMをdataに格納
tmp <- cbind(rownames(data), data)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

#おまけとして、RPM正規化後のデータでM-A plotを描画
param_A <- 5                                                     #A群のサンプル数を指定    
param_B <- 5                                                     #B群のサンプル数を指定
data.cl <- c(rep(1, param_A), rep(2, param_B))                   #A群を1、B群を2としたベクトルdata.clを作成
data <- RPM                                                      #RPMをdataに格納
meanA <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==1]), 1, mean))      #遺伝子ごとにA群の平均の対数を計算した結果をmeanAに格納
meanB <- log2(apply(as.matrix(data[,data.cl==2]), 1, mean))      #遺伝子ごとにB群の平均の対数を計算した結果をmeanBに格納
x_axis <- (meanA + meanB)/2                                      #「A群の平均値」と「B群の平均値」の平均をとったものがM-A plotのA(x軸の値)に相当するものなのでx_axisに格納)
y_axis <- meanB - meanA                                          #いわゆるlog比(logの世界での引き算)がM-A plotのM(y軸の値)に相当するものなのでy_axisに格納)
plot(x_axis, y_axis, xlab="A = (log2(B)+log2(A))/2", ylab="M = log2(B)-log2(A)", pch=20, cex=.1)#MA-plotを描画
grid(col="gray", lty="dotted")                                   #指定したパラメータでグリッドを表示

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f1 <- "SupplementaryTable2_changed.txt"                       #読み込みたい発現データファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "ens_gene_46_length.txt"                                #アノテーション情報ファイルを指定してin_f2に格納
out_f <- "SupplementaryTable2_changed_RPKM.txt"                  #出力ファイル名を指定
param1 <- 1000000                                                #補正後の総リード数(per million mapped readsにするところ)を指定(RPKMにしたい場合はここの数値はそのまま)
param2 <- 1000                                                   #補正後の配列長(per kilobase of exonにするところ)を指定(RPKMにしたい場合はここの数値はそのまま)

#まずはEnsembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてRPM正規化
library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
library(edgeR)                                                   #パッケージの読み込み
data <- read.table(in_f1, header=TRUE, row.names=1, sep="\t", quote="")#発現データファイルの読み込み
data <- data[order(rownames(data)),]                             #Ensembl Gene IDのアルファベット順に行列dataの行を並び替えている
norm_f_RPM <- param1/colSums(data)                               #各列に対して掛ける正規化係数を計算してnorm_f_RPMに格納
RPM <- sweep(data, 2, norm_f_RPM, "*")                           #norm_f_RPMを各列に掛けた結果をRPMに格納

#Ensembl Gene IDをアルファベット順に並び替えてgene_length情報を取得
tmp <- read.table(in_f2, header=TRUE, sep="\t", quote="")        #アノテーション情報ファイルの読み込み
gene_length <- tmp[,2]                                           #配列長をgene_lengthに格納
names(gene_length) <- tmp[,1]                                    #gene_length中の値とEnsembl Gene IDを対応づけている
gene_length <- gene_length[order(names(gene_length))]            #Ensembl Gene IDのアルファベット順にgene_length中の要素を並び替えている

#RPKM正規化をするために、gene_length情報があるデータのみ抽出し、そのサブセットのみでRPKM正規化
common <- intersect(names(gene_length), rownames(RPM))           #二つのベクトル(names(gene_length)とrownames(RPM))の積集合(intersection)をcommonに格納
obj_gene_length <- is.element(names(gene_length), common)        #commonで指定したEnsembl Gene IDsのnames(gene_length)中における位置情報をobj_gene_lengthに格納
obj_RPM <- is.element(rownames(RPM), common)                     #commonで指定したEnsembl Gene IDsのrownames(RPM)中における位置情報をobj_RPMに格納
gene_length_sub <- gene_length[obj_gene_length]                  #gene_lengthベクトルの中から、obj_gene_lengthがTRUEとなっているもののみ抽出してgene_length_subに格納
RPM_sub <- RPM[obj_RPM,]                                         #行列RPMからobj_RPMがTRUEとなっている行のみ抽出してRPM_subに格納
norm_factor2 <- param2/gene_length_sub                           #各行に対して掛ける正規化係数を計算してnorm_factor2に格納
RPKM <- sweep(RPM_sub, 1, norm_factor2, "*")                     #norm_factor2を行列RPM_subの各行に掛けた結果をRPKMに格納

tmp <- cbind(rownames(RPM_sub), gene_length_sub, RPKM)               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
in_f1 <- "SRR002323.bowtiebed"                                   #BED formatファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "refFlat.txt"                                           #refFlat formatファイルを指定してin_f2に格納
out_f <- "SRR002323.bowtieexp"                                   #出力ファイル名を指定してout_fに格納

library(DEGseq)                                                  #パッケージの読み込み
out <- getGeneExp(in_f1, refFlat=in_f2, output=out_f)            #発現レベルを計算(一応結果をoutに格納しているが、出力ファイルの内容と同じです)

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
out[,3]                                                          #3列目のRPKMの情報のみ抽出したいとき

------    ここまで    ------

1. 「seq2.fasta vs. seq3.fasta」のlocal alignmentの場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "seq2.fasta"                                            #読み込みたいファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "seq3.fasta"                                            #読み込みたいファイル名を指定してin_f2に格納
param1 <- "local"                                                #アラインメントのタイプ（local, global, overlap, global-local, local-globalのいずれか）を指定
param2 <- -10                                                    #gap opening panalty（ギャップ開始ペナルティ）を指定（-10がデフォルト）
param3 <- -0.5                                                   #gap extension penalty（ギャップ伸長ペナルティ）を指定（-4がデフォルト）

file <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4"          #置換行列ファイル(EDNAFULLのものはNUC.4.4に相当)のURLをfileに格納
submat <- as.matrix(read.table(file, check.names=FALSE))         #fileを読み込んでsubmatに格納
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
read1 <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                 #in_f1で指定したファイルの読み込み
read2 <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルの読み込み
out <- pairwiseAlignment(pattern=read1,subject=read2,type=param1,#アラインメントを実行し、結果をoutに格納
           gapOpening=param2,gapExtension=param3,substitutionMatrix=submat)#アラインメントを実行し、結果をoutに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#out中の情報抽出あれこれ：
out@pattern                                                      #in_f1で指定した配列中のアラインメントされた領域を表示
out@subject                                                      #in_f2で指定した配列中のアラインメントされた領域を表示
out@score                                                        #アラインメントスコアを表示

#二つの配列のIDとアラインメントスコアをファイルに出力：
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
tmp <- cbind(names(read1), names(read2), out@score)              #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. multi-fastaファイル中の「seq3 vs. seq1」のglobal alignmentの場合：
------    ここから    ------
in_f <- "test2.fasta"                                            #読み込みたいmulti-fasta形式のファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "global"                                               #アラインメントのタイプ（local, global, overlap, global-local, local-globalのいずれか）を指定
param2 <- 3                                                      #multi-fasta入力ファイルの何番目の配列かを指定
param3 <- 1                                                      #multi-fasta入力ファイルの何番目の配列かを指定
param4 <- -10                                                    #gap opening panalty（ギャップ開始ペナルティ）を指定（-10がデフォルト）
param5 <- -0.5                                                   #gap extension penalty（ギャップ伸長ペナルティ）を指定（-4がデフォルト）

file <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4"          #置換行列ファイル(EDNAFULLのものはNUC.4.4に相当)のURLをfileに格納
submat <- as.matrix(read.table(file, check.names=FALSE))         #fileを読み込んでsubmatに格納
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルの読み込み
out <- pairwiseAlignment(pattern=reads[param2],subject=reads[param3],type=param1,#アラインメントを実行し、結果をoutに格納
           gapOpening=param4,gapExtension=param5,substitutionMatrix=submat)#アラインメントを実行し、結果をoutに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#二つの配列のID,アラインメントスコア,%identidyをファイルに出力：
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
tmp <- cbind(names(reads[param2]), names(reads[param3]), score(out), pid(out))#ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

------    ここから    ------
#まずはアラインメント結果outの取得
in_f1 <- "seq2.fasta"                                            #読み込みたいファイル名を指定してin_f1に格納
in_f2 <- "seq3.fasta"                                            #読み込みたいファイル名を指定してin_f2に格納
param1 <- "local"                                                #アラインメントのタイプ（local, global, overlap, global-local, local-globalのいずれか）を指定
param2 <- -10                                                    #gap opening panalty（ギャップ開始ペナルティ）を指定（-10がデフォルト）
param3 <- -0.5                                                   #gap extension penalty（ギャップ伸長ペナルティ）を指定（-4がデフォルト）

file <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4"          #置換行列ファイル(EDNAFULLのものはNUC.4.4に相当)のURLをfileに格納
submat <- as.matrix(read.table(file, check.names=FALSE))         #fileを読み込んでsubmatに格納
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
read1 <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                 #in_f1で指定したファイルの読み込み
read2 <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルの読み込み
out <- pairwiseAlignment(pattern=read1,subject=read2,type=param1,#アラインメントを実行し、結果をoutに格納
           gapOpening=param2,gapExtension=param3,substitutionMatrix=submat)#アラインメントを実行し、結果をoutに格納

#ここからがいろいろな情報を取得するやり方
out                                                              #まずはデフォルトのoutの中身を表示
score(out)                                                       #アラインメントスコアを表示
pattern(out)                                                     #左側の配列（この場合seq2に相当；pattern）のアラインメントされた領域を表示
subject(out)                                                     #右側の配列（この場合seq2に相当；subject）のアラインメントされた領域を表示
nchar(out)                                                       #アラインメントされた領域（gapを含む）の長さを表示
nmatch(out)                                                      #アラインメントされた領域の一致塩基数を表示
nmismatch(out)                                                   #アラインメントされた領域の不一致塩基数を表示
nedit(out)                                                       #アラインメントされた領域のレーベンシュタイン距離（Levenshtein distance）を表示（nedit(out) + nmatch(out) = nchar(out)です）
pid(out)                                                         #アラインメントされた領域の配列一致度（percent identity）を表示

------    ここまで    ------

1. 特定の配列が入力multi-fastaファイルの1番目にある場合：
------    ここから    ------
in_f <- "test2.fasta"                                            #読み込みたいmulti-fasta形式のファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "local"                                                #アラインメントのタイプ（local, global, overlap, global-local, local-globalのいずれか）を指定
param2 <- 1                                                      #multi-fasta入力ファイルの何番目の配列かを指定
param3 <- -10                                                    #gap opening panalty（ギャップ開始ペナルティ）を指定（-10がデフォルト）
param4 <- -0.5                                                   #gap extension penalty（ギャップ伸長ペナルティ）を指定（-4がデフォルト）

file <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4"          #置換行列ファイル(EDNAFULLのものはNUC.4.4に相当)のURLをfileに格納
submat <- as.matrix(read.table(file, check.names=FALSE))         #fileを読み込んでsubmatに格納
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルの読み込み
out <- pairwiseAlignment(pattern=reads[-param2],subject=reads[param2],type=param1,#アラインメントを実行し、結果をoutに格納
           gapOpening=param3,gapExtension=param4,substitutionMatrix=submat)#アラインメントを実行し、結果をoutに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#比較している配列の組み合わせ数などの情報を得たい：
names(reads[param2])                                             #param2で指定した特定の配列のIDを表示（"subject"に相当）
names(reads[-param2])                                            #param2で指定した特定の配列"以外"のID(s)を表示（"pattern"に相当）
length(reads[-param2])                                           #ペアワイスアラインメント（pairwise alignment）をいくつやっているのか表示

#out中の情報抽出あれこれ：
out[1]                                                           #1つ目のペアワイズアラインメント結果を表示
out[1]@score                                                     #1つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out[1])                                                    #1つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
out[2]                                                           #2つ目のペアワイズアラインメント結果を表示
out[2]@score                                                     #2つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out[2])                                                    #2つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out)                                                       #ペアワイズアラインメント結果のスコアを全て表示

#比較した二配列のIDとアラインメントスコアをファイルに出力：
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
tmp <- NULL
for(i in 1:length(reads[-param2])){
    tmp <- rbind(tmp, c(names(reads[-param2])[i], names(reads[param2]), out[i]@score))#ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
}
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

2. 特定の配列が入力multi-fastaファイルの3番目にある場合：
------    ここから    ------
in_f <- "test2.fasta"                                            #読み込みたいmulti-fasta形式のファイル名を指定してin_fに格納
param1 <- "local"                                                #アラインメントのタイプ（local, global, overlap, global-local, local-globalのいずれか）を指定
param2 <- 3                                                      #multi-fasta入力ファイルの何番目の配列かを指定
param3 <- -10                                                    #gap opening panalty（ギャップ開始ペナルティ）を指定（-10がデフォルト）
param4 <- -0.5                                                     #gap extension penalty（ギャップ伸長ペナルティ）を指定（-4がデフォルト）

file <- "ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4"          #置換行列ファイル(EDNAFULLのものはNUC.4.4に相当)のURLをfileに格納
submat <- as.matrix(read.table(file, check.names=FALSE))         #fileを読み込んでsubmatに格納
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                  #in_fで指定したファイルの読み込み
out <- pairwiseAlignment(pattern=reads[-param2],subject=reads[param2],type=param1,#アラインメントを実行し、結果をoutに格納
           gapOpening=param3,gapExtension=param4,substitutionMatrix=submat)#アラインメントを実行し、結果をoutに格納

#以下は（こんなこともできますという）おまけ
#比較している配列の組み合わせ数などの情報を得たい：
names(reads[param2])                                             #param2で指定した特定の配列のIDを表示（"subject"に相当）
names(reads[-param2])                                            #param2で指定した特定の配列"以外"のID(s)を表示（"pattern"に相当）
length(reads[-param2])                                           #ペアワイスアラインメント（pairwise alignment）をいくつやっているのか表示

#out中の情報抽出あれこれ：
out[1]                                                           #1つ目のペアワイズアラインメント結果を表示
out[1]@score                                                     #1つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out[1])                                                    #1つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
out[2]                                                           #2つ目のペアワイズアラインメント結果を表示
out[2]@score                                                     #2つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out[2])                                                    #2つ目のペアワイズアラインメント結果のスコアを表示
score(out)                                                       #ペアワイズアラインメント結果のスコアを全て表示

#比較した二配列のIDとアラインメントスコアをファイルに出力：
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定
tmp <- NULL
for(i in 1:length(reads[-param2])){
    tmp <- rbind(tmp, c(names(reads[-param2])[i], names(reads[param2]), out[i]@score))#ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
}
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

1. DHFR.fastaを入力として、"AATGCTCAGGTA"でキーワード探索を行う場合（No hitです...）：
------    ここから    ------
in_f <- "DHFR.fasta"                                             #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
param <- "AATGCTCAGGTA"                                          #調べたい配列パターンを指定してparamに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- vmatchPattern(pattern=param, subject=seq)                 #paramで指定した配列と100%マッチの領域を探索して結果をoutに格納
out[[1]]                                                         #outの中身を表示（入力ファイル中には一致領域がないことを示している）

------    ここまで    ------

2. DHFR.fastaを入力として、"CCTACTATGT"でキーワード探索を行う場合（存在することが分かっている断片配列）：
------    ここから    ------
in_f <- "DHFR.fasta"                                             #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
param <- "CCTACTATGT"                                            #調べたい配列パターンを指定してparamに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- vmatchPattern(pattern=param, subject=seq)                 #paramで指定した配列と100%マッチの領域を探索して結果をoutに格納
out[[1]]                                                         #outの中身を表示（入力ファイルの(13,22)の位置に一致領域があることを示している）
unlist(out)                                                      #outの中身を表示（入力ファイルの(13,22)の位置に一致領域があることを示している）
start(unlist(out))                                               #一致領域のstart位置情報の抽出

------    ここまで    ------

3. DHFR.fastaを入力として、"CCTACTATGT"でキーワード探索を行った結果をファイルに保存する場合：
------    ここから    ------
in_f <- "DHFR.fasta"                                             #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge.txt"                                              #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param <- "CCTACTATGT"                                            #調べたい配列パターンを指定してparamに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- vmatchPattern(pattern=param, subject=seq)                 #paramで指定した配列と100%マッチの領域を探索して結果をoutに格納
tmp <- cbind(start(unlist(out)), end(unlist(out)))               #一致領域の(start, end)の位置情報をtmpに格納
colnames(tmp) <- c("start", "end")                               #行列tmpの列名を追加
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

4. multi-fastaファイルhoge4.faを入力として、"AGG"でキーワード探索を行う場合：
------    ここから    ------
in_f <- "hoge4.fa"                                               #読み込みたいFASTA形式のファイル名を指定してin_fに格納
out_f <- "hoge2.txt"                                             #出力ファイル名を指定してout_fに格納
param <- "AGG"                                                   #調べたい配列パターンを指定してparamに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f, format="fasta")                    #in_fで指定したファイルの読み込み

#本番
out <- vmatchPattern(pattern=param, subject=seq)                 #paramで指定した配列と100%マッチの領域を探索して結果をoutに格納
hoge <- cbind(start(unlist(out)), end(unlist(out)))              #一致領域の(start, end)の位置情報をhogeに格納
colnames(hoge) <- c("start", "end")                              #行列hogeに列名を付加
rownames(hoge) <- names(unlist(out))                             #行列hogeに行名を付加
tmp <- cbind(rownames(hoge), hoge)                               #ファイルに出力したい情報を連結してtmpに格納
write.table(tmp, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F)#tmpの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

5. multi-fastaファイルhoge4.faをリファレンス配列（マップされる側）として、10リードからなるdata_seqlogo1.txtでマッピングを行う場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "hoge4.fa"                                              #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "data_seqlogo1.txt"                                     #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f2に格納
out_f <- "hoge3.txt"                                             #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                   #in_f1で指定したファイルの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルの読み込み

#本番
out <- c("in_f2", "in_f1", "start", "end")                       #最終的に得る出力ファイルのヘッダー情報を指定してoutに格納(4列のデータを得る)
for(i in 1:length(reads)){                                       #リード数分だけループを回す
    tmp <- vmatchPattern(pattern=as.character(reads[i]), subject=seq)#オブジェクトreads中の各塩基配列と100%マッチの領域を探索して結果をtmpに格納
    hoge1 <- cbind(start(unlist(tmp)), end(unlist(tmp)))         #一致領域の(start, end)の位置情報をhoge1に格納
    hoge2 <- names(unlist(tmp))                                  #ヒットしたリファレンス配列中のIDをhoge2に格納
    hoge3 <- rep(as.character(reads[i]), length(hoge2))          #hoge2の要素数分だけ、マップする側の配列(in_f2で指定するものに相当)のIDをhoge3に格納
    out <- rbind(out, cbind(hoge3, hoge2, hoge1))                #cbind(hoge3, hoge2, hoge1)で表される欲しい情報をどんどんオブジェクトoutの下に追加している(ループが回るたびにどんどん行数が増えていっているイメージ)
}
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#resultの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

6. multi-fastaファイルhoge4.faをリファレンス配列（マップされる側）として、4リードからなるdata_reads.txtでマッピングを行う場合：
------    ここから    ------
in_f1 <- "hoge4.fa"                                              #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "data_reads.txt"                                        #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f2に格納
out_f <- "hoge4.txt"                                             #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                   #in_f1で指定したファイルの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルの読み込み

#本番
out <- c("in_f2", "in_f1", "start", "end")                       #最終的に得る出力ファイルのヘッダー情報を指定してoutに格納(4列のデータを得る)
for(i in 1:length(reads)){                                       #リード数分だけループを回す
    tmp <- vmatchPattern(pattern=as.character(reads[i]), subject=seq)#オブジェクトreads中の各塩基配列と100%マッチの領域を探索して結果をtmpに格納
    hoge1 <- cbind(start(unlist(tmp)), end(unlist(tmp)))         #一致領域の(start, end)の位置情報をhoge1に格納
    hoge2 <- names(unlist(tmp))                                  #ヒットしたリファレンス配列中のIDをhoge2に格納
    hoge3 <- rep(as.character(reads[i]), length(hoge2))          #hoge2の要素数分だけ、マップする側の配列(in_f2で指定するものに相当)のIDをhoge3に格納
    out <- rbind(out, cbind(hoge3, hoge2, hoge1))                #cbind(hoge3, hoge2, hoge1)で表される欲しい情報をどんどんオブジェクトoutの下に追加している(ループが回るたびにどんどん行数が増えていっているイメージ)
}
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#resultの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------

7. multi-fastaファイルhoge4.faをリファレンス配列（マップされる側）として、4リードからなるdata_reads.txtでマッピングを行う場合(hoge1オブジェクトの作成のところの記述の仕方が若干異なる)：
------    ここから    ------
in_f1 <- "hoge4.fa"                                              #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f1に格納
in_f2 <- "data_reads.txt"                                        #読み込みたいFASTA形式ファイルを指定してin_f2に格納
out_f <- "hoge5.txt"                                             #出力ファイル名を指定してout_fに格納

#必要なパッケージをロード
library(Biostrings)                                              #パッケージの読み込み

#入力ファイルの読み込み
seq <- readDNAStringSet(in_f1, format="fasta")                   #in_f1で指定したファイルの読み込み
reads <- readDNAStringSet(in_f2, format="fasta")                 #in_f2で指定したファイルの読み込み

#本番
out <- c("in_f2", "in_f1", "start", "end")                       #最終的に得る出力ファイルのヘッダー情報を指定してoutに格納(4列のデータを得る)
for(i in 1:length(seq)){                                         #リファレンス配列数分だけループを回す
    tmp <- matchPDict(PDict(reads), seq[[i]])                    #リファレンス配列中のi番目の配列に対してオブジェクトreads中の全配列をmatchPDict関数を用いてマッピングした結果をtmpに格納
    hoge1 <- cbind(start(unlist(tmp)), end(unlist(tmp)))         #一致領域の(start, end)の位置情報をhoge1に格納
    hoge2 <- names(unlist(tmp))                                  #ヒットしたリードのIDをhoge2に格納
    hoge3 <- rep(names(seq[i]), length(hoge2))                   #hoge2の要素数分だけ、マップされる側のリファレンス配列(in_f1で指定するものに相当)のIDをhoge3に格納
    out <- rbind(out, cbind(hoge3, hoge2, hoge1))                #cbind(hoge3, hoge2, hoge1)で表される欲しい情報をどんどんオブジェクトoutの下に追加している(ループが回るたびにどんどん行数が増えていっているイメージ)


    #as.integer(coverage(tmp, 1, width(seq[i])))
}
write.table(out, out_f, sep="\t", append=F, quote=F, row.names=F, col.names=F)#resultの中身をout_fで指定したファイル名で保存。

------    ここまで    ------